耳鸣动物模型的研究进展

梁琼综述 王武庆 审校

耳鸣动物模型的研究进展

梁琼1综述 王武庆1审校

耳鸣指在无外界声、光刺激下，患者耳内或颅内的声音感觉，一般多作为疾病的并发症出现［1］。耳鸣的发病机制至今仍不清楚，但目前有研究表明耳鸣的产生不仅是由听觉系统兴奋抑制失衡导致的，听觉系统与自主神经系统、边缘系统间的信号传递也参与了耳鸣的形成，并造成中枢神经系统的重塑［2］。在中国，虽然没有确切的流行病学统计数据，但据估计耳鸣患者有1.2亿，约占总人口的10%［3］。

耳鸣可使患者产生抑郁、泛焦虑症等［4］严重的情绪反应，而焦虑等不良情绪使患者对耳鸣更易感知［5］，形成恶性循环，造成情绪行为上的异常。因此，建立耳鸣动物模型对耳鸣的产生机制、病理生理变化［6］、治疗药物筛选及疗效评估［7］的研究显得十分迫切。由于动物无法用言语表达它的感觉，使得长期以来对耳鸣的研究局限于人类，大大限制了其研究的深入［8］。自从饮水抑制耳鸣动物模型［9］出现后，人们在该模型的基础上不断提高认识，提出了惊跳反射模型［10］。惊跳反射模型在一定程度上弥补了以条件反射为基础的耳鸣动物模型的某些缺点，同时随着对惊跳反射模型相关影响因素的研究，该模型得到不断的完善，成为未来建立耳鸣模型的一个方向。通过对耳鸣动物模型进行研究并与相关的影像、生理学检测方法相结合，可促进人们更深入地认识耳鸣，本文对此综述如下。

1 耳鸣动物模型的建立方法

虽然有多种方式可诱发耳鸣，但目前采用的多是噪声和耳毒性药物这两种方法［11］。在此基础上建立的动物模型不仅可以检测耳鸣诱导是否成功，还可以研究药物治疗耳鸣的疗效、耳鸣相关的神经生理学机制等。

1.1 水杨酸诱导的耳鸣 Mongan等［12］发现几乎所有大量使用水杨酸的风湿病患者都发生了耳鸣伴暂时性听力下降。理论上，可以导致人类耳鸣的药物也可以诱导动物产生耳鸣，因此目前建立的耳鸣动物模型很多是由水杨酸诱导的。

水杨酸对耳鸣的诱导作用呈剂量依赖性［13］，诱导耳鸣的最小有效剂量可因动物的种属、注射时间的长短而产生变化［14］，从而产生急性、可逆性的耳鸣，其耳鸣感觉与宽带噪声相似。水杨酸的药代动力学显示水杨酸在脑脊液中的浓度水平较血清中晚2～4小时出现，因而在听觉系统中的作用也在水杨酸注射后2小时左右发生［15］，这个过程是可逆的，大部分在1～2天后消除［13］。

目前，水杨酸诱发耳鸣的作用部位及机制尚未明确。大量动物实验及文献表明，在外周，水杨酸对耳蜗形态结构无明显损伤［16］，主要是对耳蜗功能有一定的损害［8，9］，同时下调外毛细胞质膜的快蛋白活动，导致听力下降［17］；李树华等［18］发现水杨酸导致豚鼠离体耳蜗的外毛细胞内钙离子浓度增高，细胞功能障碍，因此认为耳蜗感觉细胞内钙离子超载可能是水杨酸耳毒性机制之一。同时，水杨酸较易通过血脑屏障［19］，下调5-HT［20］及GABA［21］活动，对中枢系统有作用，它不仅直接作用于听皮层的神经元［22］，还作用于海马，对情绪、记忆、学习等功能产生影响［23］。

1.2 噪声诱导的耳鸣 有资料显示，噪声虽然可使毛细胞保持完整性，但会损害相应的传入神经末端，并进一步损害蜗神经［24］，使神经同步放电活动增加，传入兴奋抑制失衡，导致中枢神经的重塑［25］。在听觉敏感的频率范围内，中间频率较阈值频率的噪声更易诱发动物耳鸣［10］。由噪声诱导的急性耳鸣频谱较宽，频率高于噪声频率，急性耳鸣消失后，即使噪声刺激消失，若干年后依然可能产生慢性耳鸣，它的频谱限制在一个较窄的范围内［25］。即使噪声是纯音，它诱发的耳鸣频谱依然是宽带的［26］。

2 耳鸣动物模型的检测

2.1 以条件反射为基础的耳鸣动物模型检测Jastreboff等［9］于1988年首次建立了饮水抑制耳鸣动物模型，该模型使大鼠形成了声音存在时是安全的，而安静往往伴随着危险因素这样一个条件反射，用舔水抑制率作为耳鸣检测指标，观察条件反射消除的过程，用动物行为的改变来说明模型建立成功与否。该实验训练大鼠在持续背景噪声时舔水，在安静环境中因惧怕电击，舔水行为减少，当这种条件反射稳定存在后，依然给予背景噪声，但噪声停止后不给予电击刺激，大鼠将逐渐遗忘与电击相关的恐惧。若动物已用水杨酸诱发耳鸣，在背景噪声停止后，被掩蔽的耳鸣暴露出来，耳鸣作为一种声音感觉，和安静环境相比，它与背景噪声接近，动物不易完全区分，此时动物仍感觉自身是安全的，舔水次数减少不明显，动物能更快的遗忘恐惧，消除期缩短［］。

饮水抑制模型比较适合建立急性耳鸣的动物模型［27］，但动物舔水次数过高，变化范围较广，个体差异较大。因此，有学者使用食物抑制模型［28］，在该模型中动物摄食次数少，较集中分布在50～120次，个体差异小。Bauer等［27］建立的食物抑制动物模型较适合模拟因长期暴露在噪声刺激下造成的慢性耳鸣，这与人类耳鸣的发生过程相似，同时，动物在长达17个月的时间内可重复检测到耳鸣，可收集大量的动物耳鸣相关数据。

抑水、抑食等过程对动物的全身状态有影响，为减少这些影响因素的作用，满足动物身体状况的特殊要求，Guitton等［13］建立了跳台反射模型。

Ruttiger等［29］在检测时采用奖励性的刺激代替电击等惩罚性刺激，可降低动物的不良情绪行为反应，使实验结果受到的干扰减少。

虽然大部分耳鸣患者是双耳耳鸣，但仍有一部分患者是单侧耳鸣且有一定的偏向性，据统计，左耳发病率是右耳的1.5倍［3］，因此，Heffner等［30］建立了单侧耳鸣动物模型，给予有渴觉的仓鼠左、右两个不同方向的声刺激，当仓鼠成功辨明声音来源的方向并向相应的方向移动时给予饮水奖励，而移动方向错误时，给予微弱的电击。

以上建模方法都是通过使动物建立与所选行为学指标直接相关的条件反射，然后记录背景噪声关闭前后动物行为学指标的变化来确定动物是否感受到耳鸣。同时，许多模型的建立需要造成动物的饥饿、渴觉，受动物记忆、学习及动机状态的影响，建模过程复杂，耗时耗力［31］。目前国内多采用这些条件反射的方法来建立耳鸣的动物模型。

2.2 以惊跳反射为基础的耳鸣动物模型的检测为减少以上各种因素的影响，Turner等［10］把听觉惊跳反射运用到耳鸣动物模型的建立中。听觉惊跳反射不需对动物进行训练就稳定存在，简化了模型的制作过程，减少了条件限制，缩短了建模时间，成为检测耳鸣的新方向［31］。

2.2.1 听觉惊跳反射（acoustic startle reflex，ASR） 惊跳反射是动物被突发的强感觉刺激诱发的一种全身防御反应，一般表现为面部及躯体肌肉的快速收缩，常伴随着当下行为的中止以及心率的增加，可由多种感觉模式诱发［32］。听觉惊跳反射可被瞬间增强的声刺激诱发，一般采用100 dB及以上的宽带白噪声刺激［33］。人类多用眨眼反射作为ASR的反应指标，通过测量眼轮匝肌肌电图的波幅和潜伏期来表示，而啮齿类动物则通过底板传感器感受向下的作用力来反映［25，34］。

2.2.2 以惊跳反射为基础的耳鸣动物模型的检测机制 以惊跳反射为基础的耳鸣动物模型是通过观察ASR的波幅抑制程度对耳鸣相关指标进行分析的一种快速客观的检验耳鸣的方法。单耳听力下降时，对侧有功能的耳也可进行检测［10］。

前脉冲抑制（prepulse inhibition，PPI）检测的理论基础是惊跳刺激前30～500 ms出现的一个可觉察的、较弱的、不引起惊跳反应的前脉冲刺激，会对ASR产生显著的抑制作用，使波幅下降50%以上［35］。

间隙检测（gap detection）也是在听觉惊跳反射的基础上建立的［10］。研究证明，惊跳刺激开始前，在持续背景噪声中插入一段时间的相对安静环境作为“间隙”，动物对“间隙”的分辨能力与对ASR的抑制程度成正比，分辨能力越高，对ASR的抑制程度越强，反之，越弱［10］。

间隙检测和PPI检测均涉及由低位脑干到高级听觉中枢的复杂的神经通路［26］。PPI检测反映了快速、早期的对听觉信息的处理过程，可被人类和大鼠的高层次认知过程所调节［36］。除了下丘对其间隙检测有抑制作用外，人类对于高级神经中枢抑制能力的调节可能对ASR的抑制更为重要［37］。

噪声或耳毒性药物诱发耳鸣时，常会对听觉系统造成损害，导致听力下降［10］；高达80%的耳鸣患者同时有听觉过敏现象［38］。为排除听觉系统其他情况对耳鸣检测的影响，可将PPI检测与间隙检测结果进行综合分析。间隙检测、PPI检测ASR波幅均下降时，可认为是听力下降或暂时性的听觉系统处理功能失调；间隙检测ASR波幅下降但PPI检测无变化时，可认为产生了耳鸣；间隙检测、PPI检测ASR波幅均上升时，可认为有听觉过敏现象；而间隙检测下降，PPI检测上升时则认为同时有耳鸣和听觉过敏现象［39］。

2.3 耳鸣动物模型检测的不足

2.3.1 条件反射耳鸣动物模型的限制 在造模过程中通常需要对动物抑水、抑食、电击等来建立条件反射，若对这些刺激因素的控制程度不当，机体状况易受到损害，而且不同因素间的相互作用容易影响实验结果。条件反射依赖于学习、记忆、动机状态，并且训练动物达到稳定的条件反射需要一定的时间，所以这类模型所使用的动物较年长［25］，但是年龄偏大的动物学习、记忆等功能都有一定程度的衰退，而且常伴有年龄相关的听力下降［40］，对耳鸣的检测有影响，也不能用于观察耳鸣发生发展的整个过程［25］；同时，若这类动物用于对耳鸣药物治疗疗效的评估，药物可能对动物学习、记忆及动机状态有所损害，这将进一步影响条件反射［19］。条件反射顺利建立后，动物行为学检测把声音作为条件刺激，需要动物对声音感知，因此对于渐进性的听力下降者，该模型的使用也受限［34］。

2.3.2 惊跳反射耳鸣动物模型的限制 惊跳反射的抑制程度受动物种属、年龄、听力下降程度、背景噪声、间隙及前脉冲刺激的性质等多种因素的影响［37，40］。小鼠是研究年龄与耳鸣相关性的理想动物［25］，但小鼠随着年龄的增长，听觉系统逐步发育成熟至衰老，对ASR的抑制能力也同步发生变化，由升高变为减弱［40］。间隙检测和PPI检测对ASR的抑制作用均是由对声音变化的分辨能力决定的，对声音变化的分辨能力越强，对ASR的抑制能力也越强。对声音变化的分辨能力同时还受响度差、频率差等因素的影响［40］。PPI检测时背景噪声和前脉冲信号之间的频率差越大，对ASR的抑制能力越强［34］。间隙检测中背景噪声与间隙的响度差对ASR的抑制程度也有影响，响度下降程度越大，对ASR的抑制程度越大［40］。虽然两者对ASR的抑制能力均有影响，但响度差可能仅仅是频率差发生影响作用的前提，只有感受到不同频率声音后，才能对不同声音的频率变化进行识别，改变对ASR的抑制［34］。这些相关因素的参数设置对模型成功建立有一定的限制。

3 耳鸣神经生理学检测

耳鸣的行为学检测可与神经生理检测相结合，有利于对耳鸣的神经系统起源及特点进行深入的研究。神经生理学检测一般都在对动物麻醉后进行，针对清醒动物的检测较少，但麻醉剂对电生理检测结果有干扰作用，使耳鸣感觉消失并对神经活动有一定的抑制［13］；而且麻醉剂在听觉通路的多层面上对神经自发放电率和声刺激诱发的神经活动有显著的影响［41］。虽然麻醉剂不是诱发耳鸣的直接原因，但它可使曾经有耳鸣的动物在耳鸣消失后再次产生耳鸣［11］。

神经生理学研究发现高剂量的水杨酸使听神经的自发放电率（spontaneous firing rate，SFR）增加［42］。另有研究发现，水杨酸作用后，产生低频信号的神经元的SFR减少，而传导高频信号的神经纤维SFR无变化［43］；在已麻醉的大鼠下丘记录到SFR增加［44］，而听皮层SFR减少［11］；麻醉的猫在注射水杨酸90～180分钟后听皮层记录到SFR增加［45］，清醒的猫初级听皮层SFR减少［46］。SFR的记录结果变化较大，这可能与动物种属差异、麻醉剂的种类、水杨酸的剂量以及记录部位的不同有关［11］。对水杨酸诱导的耳鸣动物模型给予一个低强度的声刺激后，听神经复合动作电位下降，而给予高强度的声刺激后，动作电位没有发生改变［47］；在听皮层内，神经元同步簇放电（neural spontaneous firing）增加，局部场强增加［17］。噪声诱导的耳鸣动物初级听皮层、耳蜗背侧核SFR增加，神经元同步簇放电增加，局部场强增加［48］。

行为学检测显示，已产生耳鸣的动物，通过神经生理学检测可发现听觉通路上的一系列异常放电活动，虽然不能说明耳鸣与异常放电活动之间的因果联系，但可发现两者常伴随出现［33］，因此，可考虑对听觉通路进行电刺激，调节异常放电，以改善耳鸣。Zhang等［26］首次使用噪声诱导的耳鸣动物模型来研究听皮层电刺激（auditory cortex electrical stimulation，ACES）对大鼠行为学的影响，发现在多个不同频率的背景噪声中，ACES均可抑制耳鸣，并有后效抑制作用，使动物的间隙检测结果恢复至听觉系统未受损害的水平，推测ACES可能是通过对中枢听觉系统的重塑来抑制耳鸣，从而产生行为学上的改变，而不是直接抑制惊跳反射来发挥作用。因电刺激的部位、刺激的相关参数及耳鸣类型的不同，对耳鸣的抑制作用在不同个体间有较大的变化，有些患者甚至可能加重耳鸣，这使ACES的应用受到一定的限制［49］。

4 研究展望

现有的耳鸣动物模型无论是经典的以条件反射（如饮水抑制）为基础的模型，还是利用动物本身固有反射（如惊跳反射）的模型，都需先用一定的方式诱导动物产生耳鸣，其区别在于对动物是否确实产生耳鸣的检测方法不同。噪声及水杨酸诱导动物耳鸣的作用机制及作用部位仍需进行不断的探索。

由于以条件反射为基础建立的耳鸣动物模型的一系列缺点，惊跳反射模型的运用越来越广泛。同时，惊跳反射的抑制程度也受许多因素的影响，这些因素中许多可通过对实验动物分辨能力的影响来调节对ASR的抑制作用。只有对各相关因素的参数进行调节整合，才能建立一个ASR波幅变化敏感的动物模型，才能更容易地检测动物的耳鸣。如何最大程度缩短建模时间，获得客观、可信的数据以及结合不同检测手段研究耳鸣是需面对的挑战与研究方向。

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（2012-07-02收稿）

（本文编辑 李翠娥）

10.3969／j.issn.1006-7299.2013.04.033

时间：2013-3-11 10：03

R764.45

A

1006-7299（2013）04-0431-05

1 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉科（上海 2000031）

王武庆（Email：wwuqing＠eent.shmu.edu.cn）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20130311.1003.012.html