HIV抗体实验室检测的质量控制与管理

罗晓璐 黎建源 苏国生 韦善求 梁娟英

质量控制(quality control)，简称质控，是为了监测和评估本实验室的工作质量，以此来决定本实验各种检验结果能否发出的检查和控制手段。为达到规范或规定对数据质量要求而采取的作业技术和措施［1］。作为广西艾滋病临床治疗中心(南宁)的HIV初筛实验室，HIV抗体检测的质量控制与管理显得任务格外沉重，为了探讨HIV抗体实验室检测的质量控制与管理情况。笔者总结了近年来在HIV初筛实验室管理工作中所遇到的相关质量控制与管理问题，现将结果总结如下。

1 HIV抗体检测的方法和程序

1.1 筛查试剂 必须由国家食品药品监督管理局注册批准，批批检验合格、试剂均在有效期内。使用经过临床质量评估为敏感性和特异性都高的试剂。

1.2 筛查方法 酶联免疫试验(ELISA)，采用第三代ELISA(双抗原夹心法)。按照检验目的选取符合标准要求的筛查试剂对临床样品进行初筛检测和复检。

1.3 实验准备 试验开始前将试剂和样品放置在室温(18～23℃)，做好试剂准备。磷酸盐缓冲液:若溶液中有结晶析出，应将其置于37℃水浴箱中温浴溶解，再用蒸馏水以1:25的稀释倍数稀释浓缩液，至4℃冰箱保存2周。TMB底物液在使用之前配制，TMB溶液和过氧化脲溶液按等量均匀混合。1 m硫酸终止液是将85 ml的蒸馏水中加入5 ml浓硫酸溶液中。待试剂盒、外部质控血清及待检标本准备好后，严格按照试剂盒说明书操作并做好各项质控和安全防护要求进行筛查检测。

1.4 实验操作步骤 ①装好所需使用数目的孔条，每孔均加入100 μl样品稀释液。设阴性对照孔3个和HIV-1阳性对照孔1个，还可增设HIV-2阳性对照孔1个。②每孔各加加入待检样品及对照50 μl，未使用到的孔加满样品稀释液以溶解结合物球，避免堵塞洗板机针孔。震摇15 s左右，于(37±2)℃水浴箱孵育(60±5)min。③置全自动洗板机上洗涤6次(手工法将配好的洗涤液将反应孔完全加满，静置30～60 s，甩掉孔内洗液，在注满，反复共洗涤6次，洗完后孔上方及底部不应残存液体，禁止在滤纸上拍干)。④每孔加入100 μl底物液，勿搅动，室温避光孵育(30±2)min。⑤各孔加入1 m硫酸100 μl终止反应，震摇混匀。⑥置酶标仪上读数，单波长为450nm，双波长为450/630nm处读取OD值。

1.5 实验结果 ①阴性对照(NC)，HIV-1阳性对照(PC1)，HIV-2阳性对照(PC2)，NC必须 ＜0.25方可用，排除NC≥0.25的值，计算NC平均值。阴性对照范围为0.6倍阴性对照均值＜NC＜1.4倍阴性对照均值。②符合PC1-NC均值≥0.4，PC2-NC均值 ≥0.4条件的NC可可以使用。③Cut off值 =阴性对照均值 +0.100，小于Cut off为阴性，大于或等于Cut off为阳性。

1.6 报告 对呈阴性反应的样品，可由实施检测的实验室出具HIV抗体阴性报告;对呈阳性反应的样品，须进行复检，不能出阳性报告。

1.7 复检试验 对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。当两种符合初筛标准要求的试剂复检均为阴性，则可报报告HIV抗体阴性;如均呈阳性反应，或一阴一阳，则送AIDS确认实验室进行确认。

2 HIV抗体实验室检测的质量控制与管理

HIV抗体实验室检测的质量控制与管理必须符合《全国艾滋病检测工作规范》的要求［1］，保证检测质量。做好艾滋病实验室的质量管理，就要做到HIV抗体检测的质量保证、质量控制和质量评价。

2.1 HIV抗体筛查的质量控制与工作程序

2.1.1 质控血清的制备和保存 在每次实验中必须包含有内部对照质控血清和外部对照质控血清。内部对照是质量控制的基础，内部对照质控血清来自试剂盒内的阳阴性对照。每一次实验室检测要使用同一批号试剂盒中中的内部对照质控血清。外部对照质控血清主要是为了监控实验室检测的重复性和稳定性，同时观察试剂盒批间或孔间的差异，外部对照质控血清包括阴性、弱阳性和强阳性对照血清。也可以只设置一个弱阳性对照，浓度为该试剂盒临界值(Cut-off)的2～3倍。

2.1.2 外部对照质控血清的制备 HIV抗体阳性和阴性血清，56℃ 30 min灭活，3000 r/min，离心15 min。弱阳性对照可取HIV抗体强阳性血清用HIV抗体阴性血清梯度进行稀释并标定后取得。按一年的用量进行配制(也可加入一些不影响检测结果的防腐剂)并取0.2 μm得滤膜过滤除菌。

2.1.3 外部对照质控血清的保存 按一周实验用量分装、分类、标记、封口、-20℃冻存于非自动除霜冰箱中。外部对照血清禁止反复冻融，一旦融化后应该存放在2～8℃冰箱内，仅供使用一周。

2.1.4 外部对照质控血清的使用 每一次实验必须使用外部对照质控血清，以便监控实验的重复性和稳定性。同时可以了解批间或孔间试剂盒的差异，以绘制质控图。

2.1.5 外部对照质控物的质量要求 质控物的管间或瓶间变异必须小于监测系统预期的变异范围(cv＜20%)，并且质控物的成分应在稳定状态下。质控物应无影响ELISA反应的细菌和防腐剂。

2.2 质控图的建立及应用(以ELISA试验检测HIV抗体为例)最常用的质控图是Levey-Jennings质控图，使用累计和技术或趋势分析技术的图形可提供系统偏移和漂移的状况。

2.2.1 建立质控图参数 外部对照质控物的平均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对质控物重复测定的基础上。一般采用不同批次检测20个数据，仅做少量批次也至少做5个批次的检测，每个批次中不少于4个质控物测定结果，以建立一个临时性的平均值和标准差，当达到20批次数据后，替代临时性的平均值和标准差。算术平均值):是一组质控血清S/CO值的平均值。统计学上采用至少20次(天)所测得的外部对照质控S/CO值来结果计算出平均值。标准差(s):指样品检测值与均数之间的离散程度，是与对照血清S/CO均值有关的预期范围。通常一组S/CO值的标准差以s表示。变异系数(cv):是反映各次S/CO值相对于均值离散程度的一个指标，可以用来衡量检测的重复性或精密度。控制限:主要是由实验室根据质控物检测结果的平均值和标准差来划定。例如12s质控规则的控制限为外部对照S/CO平均值加减2个标准差;13s质控规则的控制限为外部对照S/CO平均值加减3个标准差。

2.2.2 绘制质控图 质控图是把检测数据与已确定的(计算出的)“控制限”进行比较的图，包含一条中心横线和其上、下两条平行的控制线，并按时间顺序点入本实验室每次试验质控血清的测定值。在常规条件下，对同一批质控品连续检测20次(天)或以上，收集一组S/CO值，求均数)和标准差(s)，超出2 s或3 s的数据不应删除。将质控均值)和标准差(s)分别标注在质控框架图中。以S/CO值作纵座标(Y轴)，每一次(天)试验作横座标(x轴)，绘制质控图。自第21次起，将各次质控结果依次点入质控框架图中，以使检验进入质控过程。

2.3 质控规则及使用 实验室在报告实验结果之前必须评价质控数据，可通过图形记录的检查或由计算机审核结果来决定。目前常用12s和13s质控规则。告警(12s):指外部对照的S/CO值超出+2 s范围，应分析是否可以继续检测或进一步观察。由于12s做为失控标准，会有较高的假失控概率，因此一般不采用。失控(13s):指外部对照的S/CO值超出+3 s范围，判断为失控。提示实验结果不能被接受，可能跟系统误差、随机误差或外部对照滴度下降有关。位移:主要指连续几次(3～5次)外部对照S/CO值都落在质控均值的同一侧则，提示实验条件发生一定的变化。趋势:指连续有几次(5～7次)外部对照质控S/CO值几乎往一个方向分布，通常认为是由参数的缓慢改变所引起。使用质控规则来检验随机误差和系统误差，使之成为检出较高的分析误差的能力，同时应具有较低的假失控概率。采用多标准质控方案来考察试验系统的可靠性，而多规则的质控方法能提高误差的检出率，并具有低的假失控概率。其要点为:质控结果有一次落在2 s范围意外，判断为告警状态，值得注意，并观察是否可以继续检测。出现下列情况时，应暂停检测查找原因:出现一次3 s范围的变化、连续两次出现同一方向2 s范围的变化、连续四次出现同一方向的1 s范围的变化、连续10次结果都在1 s范围内，但落在均值线的同一侧。

2.4 质控图的分析及失控处理 实验室需建立相应的质控图析及失控处理程序。当质控已执行时，使用平均值和标准差来计算该项目的质控限，将假失控概率降到最低。当出现失控时进行如重复质控测定或重新分析新的质控物不是最有效的方法，必须找出问题原因，找出解除故障的方法，并消除原因，防止将来出现同样的问题。

绘制和分析质控图的要点:①要在常规条件下建立质控图参数，用S/CO比值绘制质控图。对同一批质控物连续测定得到20个数据，求均值)和标准差(s)，超出2 s或3 s的数据不应删除。②由专人负责建立质控图，每月定期召开质控分析会，讨论本月的质量控制情况。③建议长期和稳定地使用一种质量好的试剂盒，更换不同厂家的试剂盒后，必须重新绘制质控图。④改用新批号试剂盒也应重新制作质控图。使用不同批号、不同厂家的试剂盒需在质控图上标注使用日期。发现失控，应及时填写报告单，上交负责人，分析失控原因并讨论是否发出检测报告结果。⑤使用新批次的外部对照质控物时，必须重新绘制质控图。⑥变异系数(cv)小于20%，表示外部对照处于稳定状态。

3 讨论

为了保证HIV抗体实验室检测结果的可靠性，HIV抗体初筛实验室需要建立一套规范的质量管理体系，并拥有缜密的实验室质量保证、质量控制和质量评价的计划和措施［1-5］。设立仪器的维护保养及校准制度，以保证仪器的正常运转。满足HIV实验室检测需要并尽可能对检验结果造成误差的仪器设备进行校准。主要有:酶标仪、洗板机、水浴箱、冰箱、温湿度计、移液器等。各仪器设备的校准方法按其相应的校准SOP进行。仪器设备校准后应有校准记录，并保存于仪器管理档案中。仪器设备每半年进行一次校准。仪器设备维修后需进行校准，合格方可重新投入使用。每天核对酶标读数仪、洗板机滤光片的波长，检查洗板机管道是否通畅及是否有漏液现象。每周需清洁仪器表面并保证光学零件不沾灰尘。每月检查洗涤时各孔与对应的冲洗头是否对位良好，负压是否符合工作要求。每年检查清洗滤光片，出现破裂或霉点应及时更换。根据仪器内具有的校准程序或使用校准板，对滤光片的精密度进行校准并保留记录。实验过程中发现仪器出现异常情况，应及时给予处理，必要时更换零部件。移液器1年至少应该标定1次，发现异常情况应随时进行校准。标定方法包括有色溶液光谱分析法、称量校准法、同位素计数法以及使用配套校准盒等。多道移液器校准须保证每一个加样头都能连续、准确地加样，移液器的精密度需在厂家出厂时规定的范围内。另外加强人员培训工作，工作人员必须持证上岗，建立一支具有高素质、医德好、技术精湛的实验室检测团队，还要不断增加新技术人员［2-6］。只有这样，做好HIV抗体初筛实验室的质量保证、质量控制和质量评估，HIV初筛实验室管理才有可能落到实处。

［1］中国疾病预防控制中心.全国艾滋病检测技术规范(2009年修订版)，2009:50.

［2］王兴金，张金元，吴学美，等.艾滋病抗体检测实验室质量控制探讨.中国中医药咨讯，2010，2(36):352.

［3］高丹，吴旭.艾滋病筛查实验室保证检测质量应注意的问题.中国卫生检验杂志，2008，18(2):364，374.

［4］朱丰秀，吴中发.赣州市艾滋病网络实验室质量控制状况评估.实验与检验医学，2011，29(2):157-159.

［5］乔恩发，陈会超，杨莉，等.人类免疫缺陷病毒快速检测实验室质量控制.检验医学与临床，2011，8(21):2685-2686.

［6］荣幸，张永旭，张海波.HIV筛查实验室的质量管理.当代医学，2011，17(1):37-38.