两种EDTA脱钙方法的比较

李喜红 杨海新 张睿

骨由骨组织、骨膜及骨髓等构成。骨组织是一种坚硬的有一定韧性的结缔组织，它由大量钙化的细胞间质及数种细胞组成，钙化的细胞间质即称为骨基质。骨基质由有机成分和无机成分构成，含水极少，骨基质中的有机成分由成骨细胞分泌形成，包括大量的胶原纤维(占有机成分的95%)及少量无定形基质，无机成分又称为骨盐，主要为羟磷灰石结晶(Ca10(PO4)6(OH)2)，骨基质的有机成分和无机成分紧密结合使骨十分坚硬，不能之间制成切片。

对骨组织脱钙［1］是科学研究及病理检测的常用技术，也是一大技术难点，要制作一张可用于免疫组化的骨组织切片并非容易。传统的脱钙方法主要有酸类脱钙液、螯合剂(EDTA，乙二胺四乙酸二钠)脱钙液等。酸类脱钙液虽脱钙时间较短，但是常会破坏细胞形态及骨组织的正常结构，影响病理观察及免疫组化结果。目前在实验室及临床中常用不同浓度的EDTA脱钙液对骨组织进行脱钙，这一方法不破坏骨组织的细胞结构，方便对其进行分子水平的研究。

1 材料

在实验室中获得兔下颌骨标本后，将下颌骨截断制成长约2 cm的骨段。

2 脱钙液的配制

本实验中选用15%EDTA溶液作为研究对象，将150 gEDTA、800 ml蒸馏水及50 gNaOH充分搅拌溶解后，使用浓盐酸调节PH值至7.0～7.5。

3 脱钙方法

3.1 脱钙前准备 去除骨段表面的软组织及骨膜，生理盐水冲洗标本后，放入中性福尔马林溶液中固定24 h，取标本于流动清水下冲洗20 min以清除骨组织表面的中性福尔马林。将骨段平铺于微波炉专用盒，倒入适量脱钙液，使脱钙液高度至少为骨段高度的20倍。因脱钙温度不宜过高，故脱钙前进行预实验，将蒸馏水置于微波炉中中火辐射2 min，水温可保持在45℃ ～65℃之间。脱钙终点标志为大头针无阻力穿透骨组织。

3.2 15%EDTA微波脱钙法 将盛有脱钙液及骨段的微波炉专用盒置于微波炉中，中火间歇脱钙，辐射时间为5 min/次，辐射间歇期间将标本盒置于室温下冷却10 min，每天循环50次，每天更换脱钙液，4 d后脱钙完成。

3.3 15%EDTA低温脱钙法 将标本盒置于4℃环境内，每5 d更换脱钙液，直至脱钙成功共历时47 d。

4 制片

脱钙成功后将标本常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、裱片、烤片、脱蜡、染色、中性树胶封存。

5 结果

5.1 脱钙时间 使用微波脱钙法脱钙时间较短，适合临床病理检查使使用。低温脱钙法脱钙时间较长，更适合实验室使用。

5.2 HE染色 制作HE染色切片过程中，微波脱钙法脱钙的标本有部分切片出现脱片且切片时能明显感觉到阻力略大，低温脱钙法切片容易，为出现脱片情况。两种脱钙方法处理的标本制成的切片在镜下观察见骨组织结构完整，细胞结构清晰，细胞质呈现浅枚红色，细胞核呈现蓝紫色，两者对比度强。微波脱钙法脱钙后制成的切片在高倍镜下仍可见钙化点的存在，低温脱钙法脱钙后制成的切片镜下未见钙化点，视野清晰、干净。

6 讨论

最早的脱钙方法是使用盐酸、硝酸、硫酸等强酸溶液或醋酸、甲酸等有机酸进行脱钙，使用强酸脱钙，虽然脱钙时间较短，脱钙效果也较好，但强酸对组织结构破坏性较大致使染色效果不理想，而使用有机酸脱钙作用较温和，但脱钙时间较长会致使组织膨胀同样导致组织结构改变，因此，不断有学者改善脱钙液配方，对于脱钙前的固定过程，有学者在固定前通过血管灌注法使固定液渗入组织及细胞中，这种方法使固定更加充分和均匀，这一方法保证了切片质量及染色质量。近年来EDTA脱钙液的使用越来越广泛，逐渐成为可科学研究中首选的脱钙剂，使用EDTA脱钙不损伤组织及细胞的形态结构及抗原等物质的性质，脱钙效果较好，但脱钙时间较长，不适宜需短时间内完成脱钙的标本［2］，EDTA脱钙液的浓度一般选择10%左右，浓度过高或过低都会使脱钙不充分或破坏组织结构。为解决EDTA脱钙时间较长这一缺点，有学者研究使用EDTA-微波辐射联合脱钙的方法，获得了较好的效果，脱钙时间明显缩短，HE染色效果较好［3］，但使用这种方法脱钙时加热时间不好把握，且程序较为繁琐不易掌握，容易过度脱钙对标本造成破坏。国外有学者经过使用恒温4℃环境下EDTA脱钙的方法对骨组织进行脱钙取得较好效果。

本实验中选择的两种脱钙方法具有代表性，脱钙液的浓度合适，未对细胞结构造成破坏，EDTA微波脱钙法可满足临床病理的需求，而EDTA低温脱钙法则更大程度的保存了细胞结构，且对标本完全脱钙，保证了免疫组化检测时定性定量的准确性。

［1］龚志锦，詹榕洲.病理组织制片与染色技术.上海:上海科学技术出版社，1994:280.

［2］王颖，洪丽华，吴哲，等.口腔硬组织切片的固定脱钙染色方法统计分析.吉林医学，2007，28(11):1315-1316.

［3］姚丽艳，赵伟，吕红兵.3中脱钙液对牙体牙周联合切片H-E染色效果的对比.福建医科大学学报，2006，40(3):298-299.