超声靶向破坏微泡介导基因传输在心血管疾病中的研究进展

刘阳春，李 浪

目前，基因治疗在心血管疾病中的应用日益广泛，但如何实现基因的高效转染一直备受关注。众所周知，基因直接注入后易被血液中的酶快速降解，其治疗作用不能通过裸露的基因实现；而腺病毒可能成为基因发挥治疗作用的有效载体[1]，其转染率高，但因存在肝毒性、致癌、致畸等作用而难以推广应用；裸质粒虽避免了上述不利影响，但转染率低[2]。近年来，靶向超声造影剂已成为国内外的研究热点，不仅可用于病变组织的靶向分子显像，也可与药物或基因等偶联，用于病变部位的靶向治疗，是一种高效、安全、具有靶向性的非病毒基因传输技术[3]。本文就超声靶向破坏微泡(UTMD)介导基因传输在心血管疾病中的研究进展做一综述。

1　基因治疗心血管疾病的现状

外源基因要到达靶组织发挥治疗作用，需要具备如下条件：(1)外源基因进入血循环后应避免被免疫系统或DNA酶降解；(2)能透过内膜屏障进入细胞体内；(3)避免被细胞体内的溶酶体降解；(4)能进入细胞核内发挥基因治疗作用。裸露的外源基因进入血循环后可被血液中的酶快速降解，因此要实现基因的靶向传输需借助载体。目前，基因载体主要包括病毒类载体[4]和非病毒载体[5]。

病毒类载体主要来源于腺病毒相关病毒、反转录病毒和慢病毒等，其中腺病毒[6]是应用较为广泛的病毒类基因传输载体，具有较高的基因转染率。Suckau等[7]利用腺病毒及腺病毒相关病毒运载干扰RNA，经主动脉途径注入心力衰竭大鼠体内，结果显示RNAi可使心肌细胞内受磷蛋白表达沉默，进而改善心力衰竭大鼠的血流动力学，证实病毒类载体可增加外源基因在靶组织的转染率而发挥治疗作用。虽然存在上述优点，但病毒类载体因存在潜在的肝毒性、致癌、致畸作用及免疫原性而难以推广应用[8-9]。非病毒类载体包括化学方法(如脂质体法)和物理方法(如基因枪、电击法等)。与病毒类载体相比，非病毒类载体避免了上述缺点，并可携带分子量较大的基因[10]。裸质粒是其中应用较多的一类，但易被血浆中的DNA酶降解，脂质体联合裸质粒介导基因传输虽对裸质粒起到了一定的保护作用，却同样存在转染率较低的问题[11]。物理方法作为一种侵入性基因传输方法，虽可实现基因的传输，但会带来不同程度的组织损伤[12]。因此如何实现基因安全、有效的传输一直备受关注。

2　UTMD介导基因传输的理论基础

UTMD是指携带药物或基因的超声微泡造影剂到达特定组织时，利用高机械指数的超声辐照破坏微泡，使微泡携带的药物或治疗基因在特定组织释放，从而达到对病变部位的靶向治疗。UTMD可增强细胞膜通透性，增加细胞对DNA或其他大分子物质的摄取，为实现靶向基因传输提供了可能。通过UTMD可极大降低当前临床系统给药的危险，在增加基因传输的同时把影响局限在特定部位和治疗时间。更重要的是与病毒载体相比，此方法并发症少，具有高效性、低细胞毒性和靶向性的特点，是一种有效的非病毒、适合体内基因传输的转染技术[13-14]。

研究表明，UTMD介导基因传输主要与超声空化效应有关[15-16]。这种空化效应可导致细胞膜通透性增加或细胞膜损伤，在细胞膜表面形成许多大小不等、数量不一的小孔(声孔效应)，并可使周围靶细胞间隙增宽。同时，微泡破裂产生的冲击波可促使从微泡上释放出来的药物或基因进入靶细胞。在特定空间和特定时间发射超声击破超声微泡造影剂，通过产生的空化效应和化学反应，使外源大分子有机会通过这些小孔、间隙进入细胞内，为DNA转染和表达外源基因产物提供了基础，有望实现并增强基因的转染及表达。研究证实，UTMD已成功应用于体外[17-18]和体内研究[19-20]，是一种安全、有效的非病毒基因传输技术。

3　UTMD介导基因传输治疗心血管疾病的体外应用

UTMD介导基因传输治疗心血管疾病的主要靶组织是心肌和血管。Lawrie等[17]研究发现，超声辐照可使裸DNA在血管内皮细胞的转染率能提高10倍，在联合应用超声微泡后，基因转染率能提高3 000倍。Miura等[18]以冠状动脉内皮细胞为实验对象，利用超声辐照携带有反义寡核苷酸(AS-ODNs)的超声微泡，结果证实，UTMD能明显增强AS-ODNs在内皮细胞的表达。汪国忠等[21]通过超声破坏载基因微泡介导报告基因(β-galactosidase质粒)转染心肌细胞，结果表明UTMD能明显增强报告基因在心肌细胞中的表达水平，在优化辐照参数后对细胞活性并无明显影响，再次证实UTMD是一种高效的非病毒基因转染方法。

4　UTMD介导基因传输治疗心血管疾病的体内应用

4.1UTMD与缺血性心脏病基因治疗缺血性心脏病的主要机制为促进心肌缺血区域的血管新生，改善心肌血流灌注。有研究发现，一些多肽类生长因子具有促进血管生成的作用，给予外源性生长因子可有效促进新生血管形成及缺血组织的侧支循环建立，改善组织缺血，称之为“治疗性血管生成”[22]。在治疗缺血性心脏病的基因选择方面，目前多采用血管内皮生长因子(VEGF)、纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、缺氧诱导因子(HIF-1α)、血管紧张素1(Ang-1)等[23-24]。

HGF不仅是强有力的肝细胞分裂因子，亦是一种血管生成因子，通过与血管上皮细胞、心肌细胞上相应受体结合，促进缺血组织血管再生[25]。2004年Kondo等[26]首先报道利用携带基因的超声微泡造影剂治疗缺血性心脏病，利用超声破坏携带HGF的超声微泡可实现HGF在急性心肌梗死大鼠心腔内靶向释放，结果显示UTMD介导HGF靶向传输可明显增加HGF在心肌组织中的转染率及表达水平，促进心肌组织中新生血管的形成，减小心肌梗死面积并抑制心肌梗死后左室重构。Cong 等[20]以心肌梗死大鼠为模型，取得了类似的效果。研究证实UTMD可介导干细胞因子(SCF)及基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)靶向传输，增加SCF和SDF-1α在心肌梗死区的表达，提高祖细胞及新生血管生成，改善心肌组织重构、再灌注及心功能[27]。Zhigang等[28]用UTMD介导VEGF转染大鼠缺血心肌，结果显示VEGF在大鼠心肌组织的表达水平明显升高，缺血心肌组织新生血管增多，证实UTMD介导基因靶向传输在治疗缺血性心脏病中具有广阔的应用前景。

4.2UTMD与冠状动脉介入治疗经皮冠状动脉介入(PCI)是目前治疗急性冠脉综合征(ACS)的有效方法，PCI术后支架内再狭窄是影响患者远期疗效的主要问题。PCI易导致内皮及内皮下组织损伤，引起血小板激活和炎性递质释放进而加剧血管平滑肌细胞(VSMC)增殖并最终引起支架内再狭窄。因此，将特定基因导入损伤血管内，通过抑制炎症反应加速内皮修复，有望防治PCI术后再狭窄。研究证实，肿瘤坏死因子α(TNF-α)可促进核因子κB(NF-κB)抑制蛋白(IκB-α)降解，进而激活NF-κB，后者可通过调控炎性因子(如单核细胞趋化蛋白3，MCP-3)的表达，在防治血管再狭窄中起重要促进作用[29]。组织因子途径抑制剂(TFPI)可抑制TNF-α诱发的NF-κB活化，在防治血管再狭窄中具有可观前景[29]。Wang等[19]用球囊损伤兔的颈动脉，将带有TFPI-2的超声微泡注入体内后用超声进行辐照，结果显示超声辐照组可明显增加血管内皮细胞TFPI-2表达，进而抑制血管内血栓形成并起到抗血管再狭窄作用。引诱剂(decoy)转染是抑制基因活化的重要技术。将 decoy导入靶细胞后，decoy可与胞浆内特定转录因子结合从而阻止转录因子进入细胞核，抑制特定基因激活[30]。NF-κB decoy可阻止NF-κB 进入细胞核，进而抑制多种炎性递质表达并最终起到抗炎作用。Inagaki等[31]通过建立大鼠股动脉损伤模型，将携带有NF-κB decoy的超声微泡注入小鼠体内，通过超声辐照实现基因在损伤血管靶向传输，与对照组相比，超声辐照组的内膜/中层面积比明显减小，损伤动脉中的炎性因子水平亦有所下降，证实UTMD可介导NF-κB引诱剂在损伤血管靶向传输，进而抑制新生内膜的形成，防治PCI术后再狭窄。RNA干扰(RNAi)是指利用双链RNA(dsDNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，在心血管疾病的治疗中具有重要作用[32]。内源性或外源性dsDNA被Dicer酶切割成21～23 nt的小分子干扰RNA(siRNA)，后者与蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体(RISC)。此后，RISC介导siRNA解旋，并使反义链与其互补同源靶mRNA结合并将其切断，引发靶mRNA降解，起到转录后基因沉默作用[33]。Suzuki等[34]通过建立小鼠股动脉损伤模型，将携带siRNA的超声微泡注入体内并进行超声辐照，结果显示UTMD可明显增加损伤动脉内siRNA转染率，进而抑制血管内膜增生，并且这种方法并没有造成组织损伤或机体不良反应，证实UTMD是一种安全有效的基因传输技术，在基因治疗心血管疾病或炎症性疾病中具有重要作用。

5　存在的问题和展望

UTMD介导基因传输在心血管疾病中的研究虽取得了较多成果，但仍存在如下问题：(1)超声参数和微泡数量的应用：UTMD介导基因传输可明显增加治疗基因在靶组织的转染水平，但最佳超声参数目前还没有统一结论。研究表明，使用过高的超声参数虽可介导基因的高效转染，亦可产生不利的生物学效应，如毛细血管破裂、出血等，因此如何利用最佳的微泡参数达到最好的转染效果是目前需要解决的问题[35-36]；(2)对于不同基因不同模型下的最佳转染条件，目前国内外尚无统一标准；(3)UTMD联合携基因超声微泡在动物实验研究中取得了令人鼓舞的成绩，但应用于临床的安全性和有效性尚需进一步研究和论证。近年来，超声微泡造影剂的研制亦取得了较大进展，主要表现在超声微泡造影剂的直径减小(<8 μm)，使其能经外周静脉注射后通过肺循环最终到达靶器官或靶组织，而由微泡引起的其他脏器并发症亦未见报道，但为减少微泡用量和避免基因浪费，结合特异性配体的靶向超声造影剂有待进一步研究。

1Kota J,Chivukula RR,O′Donnell KA,et al.Therapeutic microRNA delivery suppresses tumorigenesis in a murine liver cancer model[J].Cell,2009,137(6):1005-1017.

2Haider HK,Elmadbouh I,Jean-Baptiste M,et al.Nonviral vector gene modification of stem cells for myocardial repair[J].Molecular Medicine,2008,14(1-2):79-86.

3Geis NA,Katus HA,Bekeredjian R.Microbubbles as a vehicle for gene and drug delivery:current clinical implications and future perspectives[J].Current Pharmacyeutical Design,2012,18(15):2166-2183.

4Raake PW,Hinkel R,Muller S,et al.Cardio-specific long-term gene expression in a porcine model after selective pressure-regulated retroinfusion of adeno-associated viral(AAV) vectors[J].Gene Therapy,2008,15(1):12-17.

5Su CH,Wu YJ,Wang HH,et al.Nonviral gene therapy targeting cardiovascular system[J].American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology,2012,303(6):H629-H638.

6Yao XL,Yoshioka Y,Ruan GX,et al.Optimization and internalization mechanisms of PEGylated adenovirus vector with targeting peptide for cancer gene therapy[J].Biomacromolecules,2012,13(8):2402-2409.

7Suckau L,Fechner H,Chemaly E,et al.Long-term cardiac-targeted RNA interference for the treatment of heart failure restores cardiac function and reduces pathological hypertrophy[J].Circulation,2009,119(9):1241-1252.

8Cavazzana-Calvo M,Fischer A.Gene therapy for severe combined immunodeficiency:are we there yet?[J].The Journal of Clinical Investigation,2007,117(6):1456-1465.

9Wang Z,Storb R,Lee D,et al.Immune responses to AAV in canine muscle monitored by cellular assays and noninvasive imaging[J].Molecular Therapy,2010,18(3):617-624.

10Nayerossadat N,Maedeh T,Ali PA.Viral and nonviral delivery systems for gene delivery[J].Advanced Biomedical Research,2012,1(2):27.

11Charoensit P,Kawakami S,Higuchi Y,et al.Enhanced growth inhibition of metastatic lung tumors by intravenous injection of ATRA-cationic liposome/IL-12 pDNA complexes in mice[J].Cancer Gene Therapy,2010,17(7):512-522.

12Durieux AC,Bonnefoy R,Busso T,et al.In vivo gene electrotransfer into skeletal muscle:effects of plasmid DNA on the occurrence and extent of muscle damage[J].The Journal of Gene Medicine,2004,6(7):809-816.

13Delalande A,Postema M,Mignet N,et al.Ultrasound and microbubble-assisted gene delivery:recent advances and ongoing challenges[J].Therapeutic Delivery,2012,3(10):1199-1215.

14Bekeredjian R,Katus HA,Kuecherer HF.Therapeutic use of ultrasound targeted microbubble destruction:a review of non-cardiac applications[J].Ultraschall in der Med,2006,27(2):134-140.

15Alter J,Sennoga CA,Lopes DM,et al.Microbubble stability is a major determinant of the efficiency of ultrasound and microbubble mediated in vivo gene transfer[J].Ultrasound in Medicine & Biology,2009,35(6):976-984.

16Sun Y,Kruse DE,Dayton PA,et al.High-frequency dynamics of ultrasound contrast agents[J].IEEE Transactions on Ultrasonics,Ferroelectrics,and Frequency Control,2005,52(11):1981-1991.

17Lawrie A,Brisken AF,Francis SE,et al.Microbubble-enhanced ultrasound for vascular gene delivery[J].Gene Therapy,2000,7(23):2023-2027.

18Miura S,Tachibana K,Okamoto T,et al.In vitro transfer of antisense oligodeoxynucleotides into coronary endothelial cells by ultrasound[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,298(4):587-590.

19Wang Y,Zhou J,Zhang Y,et al.Delivery of TFPI-2 using SonoVue and adenovirus results in the suppression of thrombosis and arterial re-stenosis[J].Experimental Biology and Medicine(Maywood),2010,235(9):1072-1081.

20Cong Y,Fang P,Wang CJ,et al.Effects of hepatocyte growth factor gene transfer in combination with echocardiographic destruction of microbubbles in a rat model of experimental myocardial infarction[J].Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi,2008,36(10):936-939.

21汪国忠,胡申江,郑哲岚,等.超声破裂载基因微泡增强心肌细胞报告基因的转染与表达[J].中国应用生理学杂志,2005,21(4):371-375.

22Erdo F,Buschmann IR.Arteriogenesis:a new strategy of therapeutic intervention in chronic arterial disorders.Cellular mechanism and experimental models[J].Orvosi Hetilap,2007,148(14):633-642.

23Losordo DW,Dimmeler S.Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease.Part Ⅰ:angiogenic cytokines[J].Circulation,2004,109(21):2487-2491.

24Losordo DW,Dimmeler S.Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease:part Ⅱ:cell-based therapies[J].Circulation,2004,109(22):2692-2697.

25Dixon IM.Help from within:cardioprotective properties of hepatocyte growth factor[J].Cardiovascular Research,2001,51(1):4-6.

26Kondo I,Ohmori K,Oshita A,et al.Treatment of acute myocardial infarction by hepatocyte growth factor gene transfer:the first demonstration of myocardial transfer of a "functional" gene using ultrasonic microbubble destruction[J].Journal of the American College of Cardiology,2004,44(3):644-653.

27Fujii H,Li SH,Wu J,et al.Repeated and targeted transfer of angiogenic plasmids into the infarcted rat heart via ultrasound targeted microbubble destruction enhances cardiac repair[J].European Heart Journal,2011,32(16):2075-2084.

28Zhigang W,Zhiyu L,Haitao R,et al.Ultrasound-mediated microbubble destruction enhances VEGF gene delivery to the infarcted myocardium in rats[J].Clinical Imaging,2004,28(6):395-398.

29Zhao Y,Fu Y,Hu J,et al.The effect of tissue factor pathway inhibitor on the expression of monocyte chemotactic protein-3 and IκB-alpha stimulated by tumour necrosis factor-α in cultured vascular smooth muscle cells[J].Archives of Cardiovascular Diseases,2013,106(1):4-11.

30Gambari R.Recent patents on therapeutic applications of the transcription factor decoy approach[J].Expert Opinion on Therapeutic Patents,2011,21(11):1755-1771.

31Inagaki H,Suzuki J,Ogawa M,et al.Ultrasound-microbubble-mediated NF-kappaB decoy transfection attenuates neointimal formation after arterial injury in mice[J].Journal of Vascular Research,2006,43(1):12-18.

32Poller W,Fechner H.Development of novel cardiovascular therapeutics from small regulatory RNA molecules——an outline of key requirements[J].Current Pharmaceutical Design,2010,16(20):2252-2268.

33Raja P,Wolf JN,Bisaro DM.RNA silencing directed against geminiviruses:post-transcriptional and epigenetic components[J].Biochim Biophys Acta,2010,1799(3-4):337-351.

34Suzuki J,Ogawa M,Takayama K,et al.Ultrasound-microbubble-mediated intercellular adhesion molecule-1 small interfering ribonucleic acid transfection attenuates neointimal formation after arterial injury in mice[J].Journal of the American College of Cardiology,2010,55(9):904-913.

35Li P,Cao LQ,Dou CY,et al.Impact of myocardial contrast echocardiography on vascular permeability:an in vivo dose response study of delivery mode,pressure amplitude and contrast dose[J].Ultrasound in Medicine & Biology,2003,29(9):1341-1349.

36Miller DL,Li P,Dou C,et al.Influence of contrast agent dose and ultrasound exposure on cardiomyocyte injury induced by myocardial contrast echocardiography in rats[J].Radiology,2005,237(1):137-143.