濒危药用植物平贝母的研究进展

王长宝，徐增奇，王 仲，张海军，杨洪升

平贝母(Fritillaria ussuriensis Maxim.)是百合科多年生草本植物，与川贝母(F.cirrhosa)、浙贝母(F.thunbergii)“三分天下”，为中国药典收载品种［1］，也是我国东北特产药材之一［2］。其味苦，性寒。归肺、心经。功效清热化痰，润肺止咳，开郁散结。用于治疗肺热咳嗽，久咳痰喘，心胸郁结，烦热吐血，肺炎、支气管炎等症。由于野生平贝母大多在山林荫蔽条件下，其生长地区的林木不断受到砍伐，自然植被遭受破坏，加之不断采挖和放牧等人为活动影响，野生资源逐渐减少［3］。1984年颁布的中国珍稀濒危保护植物名录(第一册)将其定为国家三级重点保护植物。本文对平贝母的生物学特性、化学成分、繁殖方法、传粉生态学和分子生物学研究进行了综述，为今后深入研究和应用提供依据。

1 生物学特性

平贝母植株长可达1 m。鳞茎由2枚鳞片组成，直径1～1.5 cm;叶轮生或对生;先端不卷曲或稍卷曲。花1～3朵，紫色而具黄色小方格，顶端的花具4～6枚叶状苞片;雄蕊6枚，花药近基着，花丝具小乳突;花柱也有乳突;花期5～6月。蒴果倒卵形，具6圆棱、3室、顶裂;内含100～150粒种子。种子扁平，半圆形至三角形，黄绿色［4］。平贝母是一种早春植物，喜凉爽湿润气候，怕干旱炎热。早春化冻即萌发出土，地温在2～4℃时开始抽茎，13～16℃时进入生长盛期。平贝母生育期极短，(从出苗到枯萎只有60天左右)，生长发育迅速(春季4月上旬至6月中旬即可完成一个生长发育过程，秋季8月上旬至10月上旬完成更新芽的分化)，每年在较凉爽的春秋二季生长，在酷热的夏天和寒冷的冬季休眠［5－6］。平贝母从种子播种到开花结果成株形成，需4～6年时间，其幼苗与成株形态有显著不同。可分为:线形叶时期、鸡舌头叶时期、四平头时期、灯笼竿时期［7－8］。平贝母分布地域较广，东北三省均有零散分布，主要分布于长白山延脉，123°～135°E，40°～48°N范围内湿润的山脚坡地阔叶林下，山地灌木林带及林间空地。海拔多在800 m以下。产地气候寒冷，年平均气温2～5℃，1月份平均气温－17～－20℃，7月份平均气温为20～23℃，温度年较差为40℃左右;终霜期五月中、下旬，初霜期9月中、下旬，无霜期110～120 d左右;年平均降水量750～1 000 mm，多集中七、八、九3个月。平贝母多生长在上层较厚、质地疏松、结构良好、富含腐殖质的棕色森林土或山地黑钙土，土壤含水量多在20%～30%左右。

2 化学成分

由于平贝母具有较强的生物活性和较高的应用价值，因此，化学成分方面的研究较多，并探索出许多有效的提取和测定方法，如滴定法、薄层色带法、分光光度法、高效液相色带法、气相色带法等，从中分离并鉴定出130多种天然化合物，主要为生物碱、生物碱苷及多糖成分［9－14］。

生物碱是平贝母最主要的次生代谢产物，我国学者朱子清从1932年开始研究贝母属生物碱骨架结构，经过20多年的努力工作取得了很大进展，沟通了贝母属生物碱和藜芦属生物碱的关系，确定了贝母生物碱的骨架。1956年，陆仁荣等从平贝母中分得一针状结晶，与贝母碱混合熔点不降低，从此引起人们才对研究平贝母化学成分重视［15］。1982年，徐东铭等从平贝母中分离和鉴定出6个化合物，即西贝素、贝母辛、平贝碱甲、平贝碱乙、西贝素苷和平贝碱苷［16］。崔东滨等从平贝母茎叶中分得贝母辛、平贝碱甲和贝母甲素、平贝定苷、平贝碱乙、平贝碱丙和平贝宁苷、腺嘌呤核苷、半乳糖醇和琥珀酸等［17］。Kitamura先后从平贝母中分离出6种生物碱:乌苏里宁、乌苏里啶、乌苏里啶酮、乌苏里酮、平贝酮和平贝碱［18－21］。1996年，陈泽乃等从平贝母的水溶性活性部位中分得胸苷和腺苷等成分，试验表明腺苷为抑制血小板聚集的主要成分，并认为核苷类可能是贝母中除生物碱外的另一类重要活性成分［22］。1997年，徐汝明等利用甲醇提取几种贝母，以层析法粗分离并用紫外分光光法测定其中核苷类化合物的种类和含量。研究结果表明平贝母中含有较高含量的腺苷及低含量的胸苷［23］。2008年，韩成花等从平贝母氯仿－乙酸乙酯提取物种分离并鉴定出棕榈酸、β－谷甾醇和曼陀罗3种单体化合物［24］。2011年，刘春红等采用乙醇沉淀、DEAE－纤维素离子交换层析和Sepharose CL－6B凝胶过滤层析法，从平贝水提取液中分离纯化得到水溶性多糖，命名为FUP－1。通过红外光谱和高效液相色谱对其结构和单糖组成进行初步分析，分子筛层析法测定其分子质量。结果表明，FUP－1为均一组分的杂多糖，主要由木糖、葡萄糖和半乳糖组成，其物质的量比为5∶1∶1，平均分子质量为 4.1 ×104D。体外抗氧化活性分析表明，FUP－1具有较强的清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基的能力［25］。2012年，Yang＆ Duan从平贝母中分离出1组新的复合成分［26］。

3 繁殖方法

平贝母既可进行有性繁殖，又可用于进行无性繁殖。用种子繁殖生长周期长，收效较慢，一般需6年左右方能收获，用鳞茎繁殖，2年便可收益，故生产上多采用鳞茎繁殖法［27－28］。利用组织培养的方法进行大规模克隆繁殖，无疑可以减轻对野生植物的采集压力，同时也是获大量优良种苗的途径之一。目前的组织培养研究着重于优化培养条件，如外植体的取材、培养基成分和激素的选择试验。赵国凡等用组织培养的方法，诱导平贝母的不同器官，形成了愈伤组织，鳞茎和植株，为促进平贝母的繁殖速度创造了条件，经过对愈伤组织的初步测定，证实有生物碱反应。而当年新鳞茎低温处理(3～7℃)后进行的组织培养，使进行“二季作”成为可能，同时也为用组织培养的方法进行贝母生物碱的工业化生产提供了重要条件。该试验证实，植物生长调节物质对平贝母离体组织的脱分化及其器官再生，具有显著的调节作用。试验还表明，愈伤组织虽经多次继代培养，其分化小鳞茎和小植株的能力仍继续保持［29］。唐巍等以平贝母无菌苗幼茎切段诱导产生的愈伤组织为试材，研究了基本培养基、蔗糖浓度、继代时间及继代周期时间对愈伤组织分化的影响。结果表明，MS基本培养基有利于不定芽的诱导，MN培养基有利于体细胞胚的诱导。在MN培养墓上，随着蔗糖浓度的升高，不定芽发生能力下降，体细胞胚发生率升高。继代时间越长，不定芽及体细胞胚的发生能力均下降。体细胞胚胎发生的最佳继代周期时间是21 d，不定芽发生的最佳继代周期时间是28 d［30］。此前的另一项研显示，平贝母愈伤组织继代过程中染色体变异，并认为染色体迁移是形成超二倍体和四倍体的原因，部分染色质迁移是形成亚二倍体和超二倍体的原因。从再生植株的染色体数目来看，继代多次后二暗体细胞频率仍占85%以上，说明再生植株在遗传上的稳定性。然而，少数单倍体及四倍体植株的出现对平贝母遗传育种和作物改良有一定参考价值［31］。2010年，李余先以MS为基本培养基，添加不同的激素配比进行平贝母鳞茎离体培养对比试验。结果表明:生长素NAA对形成愈伤组织有主导作用，添加量以0.6 mg/L，较为合适，6－BA和KT对促进芽分化都能起主导作用，6－BA 以0.4 mg/L为好，KT以1.0 mg/L为好，在生根阶段，添加2.0 mg/L 的 IBA 较为理想［32］。

4 传粉生态学

关于平贝母的传粉方式等生殖生物学特性方面较少，任跃英等对平贝母开花习性及花粉生命力研究表明，其中以8～12 h开花最多，开花率占全天87.76%，为开花高峰。平贝母柱头有效期约为8 d，从始花到柱头进入有效期约需3～4 d，因此花开放4 d后为最适授粉期。不同时期采集的花粉生命力确有差异，并且不论是TTC染色还是基质中萌发得到一致的趋势，均表现盛花期的花粉生命力最强［33］。张晓军等用TTC法测定花粉的活力，用联苯胺－过氧化氢法测定柱头的可授性，通过实地观测访花者、套袋实验、花粉－胚珠比(P/O比)的估算及花粉粒形态的观察研究了平贝母的传粉特性及繁育系统类型。结果表明，平贝母的花粉活力在开花后2～5 d可达90%以上，6 d后有所减弱，10 d后仍有71.3%的花粉保持活力。柱头的可授期约持续8 d，在开花后3～4 d柱头的可授性最强，5 d以后可授性逐渐减弱。平贝母的繁育系统是以自花传粉为主，虫媒异花传粉为辅的兼性自交。研究结果为平贝母的品种选育、杂交育种、引种栽培及物种保育提供了理论和技术依据，为深入研究贝母属植物的演化提供了生殖生态学依据［34］。

5 分子生物学

2006年，宋显伟根据Copia－like类反转座子反转录酶的保守位点设计简并引物，从平贝母基因组中扩增得到了长度为240bp左右的PCR产物。对扩增产物进行分离和克隆，并随机挑选76个克隆进行测序，结果得到了57个不同的序列。BlastX分析以及与已鉴定的Copia－like类反转座子反转录酶区域序列比对表明这些克隆序列均为真实的反转录酶序列。进行同源序列的比对发现，这些序列可分为11组，且这些核苷酸序列在组内和组间均有较大的差异，表明核苷酸序列的高度异质性。这57个序列中，仅有12个为完整的序列，其余的都有移码突变，终止子或二者兼有。Southern杂交结果显示了各组序列在平贝母基因组中的分布情况。甲基化分析则表明这些序列在平贝母的基因组中均被高度甲基化。该研究认为认为Copia－like类反转座子在平贝母中以家族的形式广泛存在，其序列间存在较大的异质性，而且，大部分为不完整的序列，表明这类反转座子在进化过程中逐渐沉默成为无功能的假基因［35］。李玉锋通过对不同产地的8种贝母RAPD的分析，探讨贝母种间的遗传差异，结果表明，地理分布距离越小，贝母的遗传差异越小，反之越大［36］。

6 展望

综上所述，前人对平贝母的研究涉猎比较广泛，但作为国家三级濒危保护植物，其当前野生资源概况并不清楚，保护生物学方面的研究始终未见报道。因此，期待开展相关研究:(1)野生种质资源调查与保存。虽然平贝母的栽培比较普遍，但由于长期的乱采烂挖，其野生资源急剧减少，最突出的问题是野生生境的大面积破坏。因此，有必要对平贝母的种质资源进行全面调查，这对于优良品种的选育、稳定药材质量和种质的可持续利用具有重要意义。(2)遗传多样性研究。由于平贝母零星分布，居群间隔大，导致居群间基因流基本上停滞;生境的破坏以及由此引起的种子适合度下降和繁育系统的变化，居群内遗传多样性的降低将会进一步加剧其对环境的适应性下降。较弱的生存能力在受到外界的干扰后，很容易导致物种的灭绝，这也要求我们加快对平贝母遗传多样性的研究。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:化学工业出版社，2005，1:25 －242.

［2］ 谢宗万.全国中草药汇编:上册［M］.北京:人民卫生出版社，1978:230－231.

［3］ 李慧婷.平贝母资源调查与品质评价［D］.沈阳:辽宁中医药大学硕士学位论文，2010，6:1 －102.

［4］ 陈心启，许介眉，梁松筠，等.中国植物志:14卷［M］.北京:科学出版社，1980:104.

［5］ 常维春，李景惠，李国英.平贝母生长发育特性及繁殖方法的观察研究［J］.特产科学实验，1982，4:6 －9.

［6］ 朱有昌.东北药用植物［M］.哈尔滨:黑龙江科学技术出版社，1989:144.

［7］ 吉林省中医中药研究所.长白山植物药志［M］.长春:吉林人民出版社.1982:1344.

［8］ 李书心.辽宁植物志:下册［M］.沈阳:辽宁科学技术出版社，1985:699.

［9］ 马莹，吴俊，赵岩，等.中心组合设计－响应面分析法优选平贝母总生物碱的超声提取工艺［J］.中国农学通报，2012，28(30):306－311.

［10］ 朱丹妮，谭丰萍，高山林.HPLC－ELSD分析测定贝母类药材中生物碱成分［J］.药物分析杂志，2000，20(2):87 －91.

［11］ 王冲之，孙健，李萍.贝母类药材生物碱及生物碱苷含量测定方法研究［J］.中国药学杂志，2003，38(6):415 －418.

［12］ Li W Y，Bi K S，QiaoY J，et al.Analysis of ipeimine in Bulbus Fritillariae pallidiflorae by HPLC after derivatization［J］.Journal of Chinese Pharm，1997，29:363.

［13］ Li P，Liu L N，Xu GJ，et al.Determination of imperialine in 12 different species of Fritillaria bulbs［J］.Chinese Traditional Herb Drugs，1991，22(9):205.

［14］ Ding K，Lin G，Ho Y P，et al.Prederivatization and high performace liquid chromatographic analysis of alkaloids in bulbs of Fritillaria［J］.Journal of Chinese Pharm，1996，85(11):1174 －1179.

［15］ 陆仁荣.贝母植物碱研究－几种川贝母中的新植物碱［J］.化学学报，1956，22(3):361.

［16］ 徐东铭，张本，李焕朵，等.平贝母生物碱的分离和鉴定［J］.药学学报，1982，17(5):355 －359.

［17］ 崔东滨，严铭铭，王淑琴.平贝母茎叶化学成分的研究［J］.中国中药杂志，1995，20(5):298.

［18］ Kitamura Y.Report on alkaloid from Fritillaria ussuriensis.Tetraberdron Letter［J］.1989，45(18):5755 －5758.

［19］ Kitamura Y.Alkaloid in Fritillaria ussuriensis.Tennen Yukikgaobustsu Toronkaikoen Yashishu［J］.1989，31(52):6829 －6832.

［20］ Kitamura Y.Report on alkaloid from Fritillaria ussuriensis.Tetraberdron Letter［J］.1989，30(3):4981 －4984.

［21］ Kitamura Y.Report on alkaloid from Fritillaria ussuriensis.Tetraberdron Letter［J］.1989，45(23):7281 －7283.

［22］ 陈泽乃，陆阳，徐佩娟.中药贝母中水溶性成分的研究［J］.中国中药杂志，1996，21(7):420 －422.

［23］ 徐汝明，陆阳.紫外分光光度法测定贝母中腺苷胸苷含量［J］.中国中药杂志，1997，22(11):682.

［24］ 韩成花，罗惠善，徐东花.平贝母氯仿和乙酸乙酯提取物化学成分的研究［J］.黑龙江中医药，2008，3:47 －48.

［25］ 刘春红，马宇，何忠梅，韩宝瑞.平贝母多糖的分离纯化及抗氧化活性研究［J］.食品科学，2011，32(21):29 －33.

［26］ Yang Z D，Duan D Z.A new alkaloid from Fritillaria ussuriensis Maxim.［J］.Fitoterapia，2012，(83):137 －141.

［27］ 张宜军，刘宝芝，尹振波等，寒地平贝母丰产栽培技术［J］.中国林副特产，1995，5(2):14 －15.

［28］ 那晓婷，陈桂英，杨鸿雁.平贝母的栽培及加工技术［J］.中国林副特产，2001，5(2):3.

［29］ 赵国凡，曹阳，吴阳，等.平贝母的愈伤组织的培养和器官再生［J］.辽宁大学学报:自然科学版，1982，1:88 －96.

［30］ 唐巍，杨映根，桂耀林，等.培养条件对平贝母愈伤组织分化的影响［J］.生物技术，1996，6(4):11 －14.

［31］ 唐巍，吴绛云，张丽梅.平贝母愈伤组织继代过程中染色体变异的研究［J］.东北农业大学学报，1994，25(1):70 －74.

［32］ 李余先，陈凯峰.平贝母鳞茎离体培养研究［J］.北方园艺，2010(3):121－122.

［33］ 任跃英，裴菊，吴玉霞，等.平贝母开花习性及花粉生命力研究［J］.特产研究1996，1:30 －32.

［34］ 张晓军，崔大练，宗宪春，等.平贝母传粉生物学及繁育系统的研究［J］.西北植物学报，2010，30(7):1404 －1408.

［35］ 宋显伟.平贝母(Fritillaria ussuriensis Maxim.)中 Copia－like类反转座子反转录酶序列的克隆与分析［D］.东北师范大学硕士学位论文，2006，5:1 －37.

［36］ 李玉锋，唐琳，陈放.8种贝母的 RAPD分析［J］.中成药，2006，28(10):1528 －1529.