二甲双胍对糖尿病大鼠种植体周围骨组织中OPG和RANKL表达的影响

刘 宇 高 莺 焦艳军*

（山西医科大学研究生院，山西 太原 030001）

二甲双胍对糖尿病大鼠种植体周围骨组织中OPG和RANKL表达的影响

刘 宇 高 莺 焦艳军*

（山西医科大学研究生院，山西 太原 030001）

目的 研究二甲双胍对糖尿病大鼠种植体模型骨组织中OPG和RANKL表达的影响，探讨血糖变化对种植体周围骨整合的意义。方法 将30只8周龄雄性SD大鼠随机分为正常种植组（T0）、糖尿病种植组（T1）、糖尿病种植二甲双胍干预组（T2）。糖尿病模型的建立采用高脂高糖饮食喂养以及腹腔注射小剂量链脲佐菌素，种植组植入纯钛种植体，降糖药物干预组每日二甲双胍灌胃。每周观察各组血糖水平，于12周处死大鼠，取胫骨，通过影像学方法观察种植体周围骨结合情况，并采用免疫组织化学方法检测各组种植体周围骨组织OPG和RANKL表达水平。结果 大鼠T1表达水平比T0和T2组都高，T0和T2组RANKL表达水平相当；在RANKL/OPG比值的两两比较中，3组差异都有统计学意义，其值由高到低分别为T1组、T2组和T0组。结论 糖尿病对种植体周围骨组织整合过程的影响可能是从升高RANKL表达水平和降低OPG表达水平两方面来起作用的，而二甲双胍可能通过改变OPG和RANKL的表达，促进种植体周围骨结合和骨形成。

二甲双胍；糖尿病大鼠；种植体；OPG；RANKL

口腔种植是用外科手段将人工材料设计的种植体在颌骨内植入，种植体支持义齿的上部结构。人工种植义齿技术的日趋完善，能显著地提高患者的咀嚼功能，且感觉舒适类似真牙，许多常规义齿难以解决的疑难临床病例得到满意疗效。

糖尿病是一种能引起以高血糖为特征，具有遗传倾向，且发病率较高的慢性疾病。有相当多的糖尿病患者伴随有不同程度的牙列缺损或牙列缺失，因糖尿病可通过多种病理机制影响着种植体周围的骨整合，因此其被列为口腔种植手术的相对禁忌症。但随着人们生活水平的不断提高，越来越多的糖尿病患者希望通过种植义齿达到改善生活质量的要求，迫使我们在研究糖尿病患者口腔种植手术的适应症方面做出更多努力。本科题通过研究二甲双胍对糖尿病大鼠种植体模型骨组织中OPG和RANKL表达的影响，为临床工作中糖尿病患者种植术前、术后合理用药，从而达到良好骨整合目的提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只8周龄健康雄性成年SD大鼠，二级动物，体质量240～260g，由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2 器材及试剂

One Touch快速血糖仪（美国强生）、牙种植机（法国赛特里）、BX-51多功能生物显微镜（OLYMPUS公司）、BI-2000医学图象分析系统（成都泰盟科技有限公司）、切片机（上海精密仪器有限责任公司）、螺纹柱状纯钛种植体、种植器械（西安中邦器械有限公司）、链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司）、柠檬酸、柠檬酸钠、2%戊巴比妥钠（天津市化学试剂三厂）、DAB显色试剂盒、即用型SABC二抗试剂盒、OPG一抗、RANKL一抗（武汉博士德公司）、盐酸二甲双胍片（天津太平洋制药有限公司），其他试剂及仪器皆为山西医科大学寄生虫实验室提供。

1.3 实验方法

1.3.1 建立2型糖尿病大鼠模型

将30只SD大鼠随机分为正常种植组（T0）、糖尿病种植组（T1）、糖尿病种植二甲双胍干预组（T2）。常规饲养2周后，T1、T2组高脂高糖饮食4周，T0组继续给予常规饮食。4周后在禁食12h的状态下T1、T2组一次性腹腔注射0.5%STZ45mg/kg。T0组注射等量的柠檬酸缓冲液。继续常规喂养2周后，禁食12h，测量血糖，血糖＞16.7mmol/L视为建模成功，否则给予剔除。

1.3.2 种植体植入及二甲双胍灌胃

术前禁食12h，采用2%戊巴比妥1mL/kg腹腔注射麻醉，麻妥后将大鼠仰卧固定于手术台上，右侧胫骨备皮，2%碘伏消毒，切开皮肤及皮下组织，寻找胫骨近骺端，距离近骺端5mm处，在生理盐水冲洗冷却下，在骨面用1.3mm×5mm的钻头制备种植窝（转速为1200转/秒），手用器械植入种植体，生理盐水冲洗创口，分层缝合皮下组织及皮肤。术后3d局部注射青霉素预防感染。种植术后1周，T2组大鼠每日二甲双胍灌胃（250mg/kg），根据血糖水平每3d调整一次药物用量使血糖接近T0组水平。T0组、T1组大鼠注射等量生理盐水。

1.3.3 骨密度检测

12周后，全麻状态下进行骨密度检测。

1.3.4 制作HE切片

切片常规石蜡脱水：二甲苯（I）10min→二甲苯（Ⅱ）10min→100%乙醇2min→95%乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸馏水洗2min。苏木素染色5min，自来水冲洗。1%盐酸乙醇分化30sec（提插数下）。自来水浸泡15min。置伊红液20sec。自来水洗30sec。脱水，透明:80%乙醇5sec→95%乙醇（Ⅱ）5sec→95%乙醇（I）5sec→100%乙醇5sec→二甲苯（Ⅱ）5sec→二甲苯（I）5sec。树脂封片。BX-51多功能生物显微镜观察种植体周围组织学形态。

1.3.5 制作免疫组化切片

切片常规石蜡脱水：二甲苯（I）10min→二甲苯（Ⅱ）10min→100%乙醇2min→95%乙醇1min→80%乙醇1min→75%乙醇1min→蒸馏水洗2min。3%过氧化氢室温10min。PBS（Ph7.4）液洗3次，每次3min。微波热修复1 min。滴加5%BSA封闭液，室温孵育20min。滴加一抗（OPG一抗、RANKL一抗，实验浓度1∶100），4℃过夜。PBS液（pH7.4）洗3次，每次3min。滴加生物素化兔抗兔抗体 37℃30min。PBS液（Ph7.4）洗3次，每次3min。滴加SABC试剂，37℃恒温箱 20min。PBS液（pH7.4）洗4次，每次5min。DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1mL蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴 ，混均后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，5min后蒸馏水洗终止显色。苏木素轻度复染，自来水洗。脱水，透明：80%乙醇5sec→95%乙醇（Ⅱ）5sec→95%乙醇（I）5sec→100%乙醇5sec→二甲苯（Ⅱ）5sec→二甲苯（I）5sec。树脂封片。BX-51多功能生物显微镜观察种植体周围骨组织中OPG和RANKL的免疫组化结果。

1.3.6 统计学分析

2 结 果

2.1 实验动物情况

各组大鼠均健康存活，T1组大鼠明显消瘦，多饮多食多尿，T2组体质量明显接近T0组，种植术后3组大鼠种植区创口愈合良好，未见炎症和感染，种植体未出现松动脱落。T1组组胫骨明显骨质薄，质地脆，T0组和T2组大鼠胫骨较T1组骨质较厚，质地较韧。

2.2 骨密度检测检测结果

结果显示T1组骨密度值低于T0组和T2组，T0组种植体周围骨密度较T2组高。

2.3 HE染色观察结果

T0组与T2组相近，破骨细胞和成骨细胞的数量均多于T1组。T1组破骨细胞数量较其余两组明显增多。

2.4 免疫组化结果

T1组OPG表达水平比T0和T2组都低，但T0和T2组OPG表达水平相当；T1组RANKL表达水平比T0和T2组都高，T0和T2组RANKL表达水平相当；在RANKL/OPG比值的两两比较中，3组差异都有统计学意义，其值又高到低分别为T1组、T2组和T0组。

3 讨 论

在目前临床工作中，糖尿病患者实施口腔种植手术的风险率一直较高，特别是对于一些血糖控制效果不好的病人，临床中更将其列为手术绝对禁忌对象。有研究显示[1]正常人种植体的长期存活率已超过95%，而Fiorellini发现2型糖尿病患者种植体1年以上种植成功率从85.6%到94.3%不等[2]。糖尿病是由于胰岛素受体或受体后缺陷导致靶细胞对胰岛素的敏感性降低所致，通常认为其通过微血管病变、免疫力下降等病理变化，降低机体组织对致病因子的抵抗力，从而影响骨整合过程。

二甲双胍是治疗胰岛素抵抗的重要制剂之一，其降糖作用的主要机制是增加胰岛素抵抗患者脂肪细胞、肌细胞的胰岛素受体（IR）与胰岛素的结合力，促进脂肪、肌肉等周围组织摄取和利用葡萄糖，抑制肝糖异生及糖原分解，减少肝糖输出，使血糖下降，同时可抑制脂肪组织分解，降低游离脂肪酸（FFA）水平，减少对β细胞的脂毒性，还可降低血胰岛素水平，增高胰岛素敏感性[3]。已有研究证明骨组织也为胰岛素敏感组织，成骨细胞表面存在高亲和性的胰岛素受体（IR）[4]，吕娇[5]等发现二甲双胍等显著增强成骨细胞的葡萄糖摄取，在高血糖引起胰岛素反应型减弱时，二甲双胍能逆转降低的糖运转活动，使成骨细胞的糖摄取进一步增强。

骨保护素（osteoprotegerin，OPG）又称为破骨细胞生成抑制因子（osteoclastogenesis inhibitory fanctor，OCIF），其主要功能是抑制破骨细胞的分化，抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性并诱导其凋亡。资料显示OPG是由前肽切除21个氨基酸的信号肽产生，其含有7个功能区（D1～D7），N端的D1～D4区参与配体结合，与抑制破骨细胞的作用直接相关[6]。核因子КB受体活化因子配体（receptor activator of NFКB ligand，RANKL），又称骨保护素配体（osteoprotegerin ligand，OPGL），能特异性的作用于细胞核因子КB受体活化因子（receptor activator of NF-КB，RANK），从而激活NF-КB，介导骨吸收。OPG/RANKL/RANK系统是介导各种物质诱导破骨细胞生成及功能的最终生物因子，三者共同参与调节破骨细胞的分化成熟和骨吸收重建。成骨细胞及骨髓基质细胞表达RANKL，与破骨细胞前体细胞或破骨细胞表面上的RANK结合后，促进破骨细胞的分化及骨吸收活性。成骨细胞及骨髓基质细胞分泌表达OPG与RANKL竞争性结合，阻止RANKL与RANK之间结合。体内诸多激素和因子通过影响OPG或RANKL的表达影响骨代谢。吴陈炫[7]等研究显示糖尿病大鼠比非糖尿病大鼠或经胰岛素治疗的糖尿病大鼠的OPGmRNA表达更低、RANKLmRNA表达更高、PANKL/OPG之比也高。相应的，糖尿病大鼠破骨细胞数比非糖尿病大鼠或经胰岛素治疗的糖尿病大鼠也更多，提示糖尿病时本身血中异常的激素和细胞因子的改变，有可能改变牙周局部OPGmRNA和RANKLmRNA表达，从而导致牙槽骨破坏。本实验从OPG和RANKL免疫组化结果来看，T1组OPG表达水平比T0和T2组都低，但T0和T2组OPG表达水平相当；T1组RANKL表达水平比T0和T2组都高，T0和T2组RANKL表达水平相当；在RANKL/OPG比值的两两比较中，3组差异都有统计学意义，其值又高到低分别为T1组、T2组和T0组。因此提示糖尿病对种植体周围骨组织整合过程的影响可能是从升高RANKL表达水平和降低OPG表达水平两方面来起作用的，而二甲双胍也可以降低血糖，可能通过改变OPG和RANKL的表达，促进种植体周围骨结合和骨形成。

[1] Beilker T,Flemming TF. Implants in the medically compromised patient[J]. Crit Rev Oral Biol Med,2003,14(4):305-316.

[2] Fiorellini JP,Chen PK,Nevins M,et al. A restrospective study of dental implants in diabetes patients [J]. Int J Periodontics Restorative Dent,2000,20(4):366-373.

[3] 张军霞,徐焱成,朱宜莲.格华止对糖尿病患者高血压的干预作用[J].浙江临床医学,2003,5(1):24-25.

[4] Cornish J,Callon KE,Reid IR. Insulin increasedhistomorphometric indices of bone formation in vivo[J]. Calcif Tissue Int,1996,59(6):492-495.

[5] 吕娇,刘洪臣,吴璇,等.二甲双胍对高糖环境下颌骨成骨细胞影响的机制研究[J].上海口腔医院,2009,18(6):12-13.

[6] 刘长庚,凌天牗,黄生高.OPG/RANKL/RANK系统及其临床应用[J].国际病理科学与临床杂志,2007,27(6):534-538.

[7] 吴陈炫,刘士有,王永兰.糖尿病大鼠牙槽骨RANKL、OPG基因表达的实验研究[D].天津:天津医科大学口腔临床医学,2007.

R587.1

B

1671-8194（2013）19-0092-03

降糖药物对糖尿病状态下植入体稳定性影响的研究（编号：20110321084）；二甲双胍对体外培养停经后骨质疏松大鼠来源的骨髓间充质干细胞增殖和分化能力的影响（基金号：YB1001）

*通讯作者：E-mail： jiaoyanjun-2000@163.com