病毒-宿主相互作用的系统生物学与宿主靶向抗病毒策略

伯晓晨，杨 静，王升启

(军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850)

病毒性疾病严重危害人类健康，历史上几次全球范围的病毒性疾病流行给人类带来了深重的灾难。近年来，甲型H1N1流感、高致病性禽流感、SARS病毒等的肆虐造成了极大的社会恐慌和难以估算的经济损失;病毒性生物恐怖剂制备技术的普及对人类安全构成了潜在威胁。虽然抗病毒药物在近20年来有了很大发展，目前在临床应用的抗病毒药物已达40多种，但许多重要病毒性疾病仍然缺乏有效的治疗药物[1]。

由于病毒基因组编码的蛋白数量非常少，以病毒蛋白为靶标的抗病毒药物在靶标选择上受到很大限制[2－4]。更为重要的是，病毒通过频繁变异极易适应和逃避药物施加的选择压力，解决病毒耐药问题成为抗病毒药物研究和开发的关键[3]。此外，由于不同种类的病毒蛋白结构差异较大，以病毒蛋白为靶的药物很难实现广谱[2－3]。近年来，宿主靶向和宿主－病毒联合靶向策略成为抗病毒药物研究的重要发展方向[5－9]。基于高通量病毒感染组学实验和计算系统生物学方法构建病毒－宿主分子相互作用网络，可以为从系统水平上辨识抗病毒药物宿主靶标提供重要基础。

1 宿主靶向抗病毒策略与宿主靶标辨识

由于病毒是严格的细胞内寄生生物，理论上可以通过抑制与病毒生存密切相关的宿主蛋白来达到抗病毒的目的。事实上，医学遗传学的相关研究已经为宿主靶向抗病毒策略提供了很多启示，宿主细胞的基因在自然突变导致功能丧失后，往往可以使宿主避免某种病毒的感染。如HIV研究发现，发生趋化因子受体 5(C－C－motif receptor 5，CCR5)基因突变的人对HIV具有天然免疫性[10]，CCR5随即成为抗HIV药物的热点宿主靶分子，其拮抗剂Maraviroc(马拉维若)也通过了美国食品及药物管理局的批准并用于临床[11－12]。最新报道的 CCR5 拮抗剂 TD－0680 在抗病毒活性上比Maraviroc高出几十倍，能广泛用于抑制不同类型的人和猴艾滋病毒[13]。

宿主靶向抗病毒策略的一个突出优势是宿主细胞提供了远比病毒丰富得多的候选药物靶标。而且，由于人基因的突变率远远低于病毒基因，宿主靶向策略还可以比较好地解决耐药问题[5]。除此之外，由于多种病毒可能会作用于相同的宿主蛋白，因此，宿主靶向药物有可能具有广谱抗病毒活性[2]。

宿主分子靶向的思想在抗痘病毒、疱疹病毒、肝炎病毒和虫媒病毒药物研究中也得到了应用。如靶向人ab1酪氨酸激酶的药物Gleevec通过阻断牛痘病毒A36R蛋白的磷酸化可以治疗牛痘病毒感染[14]，靶向维生素K2转移酶的抑制剂可治疗丁型肝炎病毒(HDV)感染[15]，靶向组蛋白去乙酰化酶HDAC1可抑制 HIV的基因表达[16]，阻断 eIF－2α的去磷酸化可抑制单纯疱疹病毒(HSV)的复制[17]等等。特别是在丙型肝炎病毒(HCV)感染治疗药物的研究中，发现了一系列具有重要价值的潜在宿主靶标，如亲环素[18]、人热应激蛋白70[19]、载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G[20]、microRNA－122[21]等。

宿主靶向抗病毒策略要解决的一个重要问题是如何在大量的宿主细胞蛋白中选择特异并低毒的抗病毒靶标。宿主靶标的辨识必须建立在对病毒－宿主相互作用网络的全面和深刻认识上。各种组学和系统生物学的兴起，为系统揭示病毒－宿主分子相互作用网络提供了有力的实验和理论工具，通过病毒感染转录组、蛋白质组、病毒－宿主蛋白相互作用组学、大规模RNAi文库和计算系统生物学技术挖掘病毒感染、致病的关键宿主分子成为是近年来宿主靶标发现的主要手段。

2 病毒－宿主相互作用相关组学

近年来，病毒感染相关组学的研究揭示病毒和宿主在分子水平上存在广泛而复杂的相互作用，引发了对于病毒－宿主分子相互作用网络研究的关注和“病毒－宿主相互作用组学”的提出[8，22－25]。

2.1 病毒感染蛋白质组学

病毒感染蛋白质组学是随着蛋白质组技术在病毒研究领域的应用而兴起的，许多重要病毒如 HIV[26]，HCV[27]，SARS[28]，流感病毒[29]等感染前后的差异蛋白质组相继被揭示。在研究方法上，从最初的2－D电泳到最近基于稳定同位素标记的定量蛋白质组在病毒感染中的应用越来越广泛[30]。Zhang等[28]利用细胞培养条件下稳定同位素标记技术(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)与质谱联用的策略比较了SARS－CoV复制子细胞与其平行的 BHK21细胞的蛋白表达情况，发现BAG3是抑制SARS－CoV RNA复制的关键宿主蛋白;Go等[31]应用ICAT技术分析被flock house virus感染的果蝇，共鉴定到1500个宿主蛋白，包括150个上调蛋白及66个下调蛋白。

考虑到病毒感染、复制过程的复杂性，上述这些静态、单一的差异蛋白质组发现方法提供的信息有限，不能系统地反映病毒与宿主相互作用的动态变化，缺乏全景式描述。需要能够分不同时间、不同组织和细胞的不同细胞器进行亚细胞定量蛋白质组学的纵深研究[32]。采用亚细胞分离蛋白不仅降低了样品的复杂性、有利于提高质谱数据的可靠性，而且还可以提供许多蛋白移位穿梭的信息。最近有研究[29]利用高通量亚细胞动态定量蛋白质组学方法分析了流感病毒感染人原代巨噬细胞早期宿主细胞的反应，发现多达1000种蛋白表达出现差异并监测到多种细胞质细胞核蛋白出现移位，发现P2X7、Src和溶酶体蛋白渗漏是流感病毒感染导致的炎症反应的三个关键效应分子或通路，为流感病毒感染导致的炎症反应提供了一个全景式网络图谱。

2.2 病毒－宿主蛋白相互作用组学

高通量蛋白质相互作用研究技术的进步为从系统水平上考察病毒－宿主分子相互作用奠定了重要实验基础。2006年以来，国际上一些知名刊物如Science，PNAS，MSB等先后报道了通过酵母双杂交技术得到的 KSHV，VZV，EBV，SARS－Cov，HCV，DENV等重要病毒与宿主之间的蛋白相互作用图谱[33－37]。

2.3 病毒感染依赖的关键宿主因子

大规模RNAi文库是后基因组时代研究基因功能、特别是发现药物靶标的重要工具。通过系统地沉默宿主基因，并观察基因沉默后的病毒感染情况，可以发现病毒感染过程依赖的关键宿主蛋白，即关键宿主因子(essential host factor)。采 用 该 策 略 先 后 完 成 了 针 对 HCV[38－39]、DENV[40]、WNV[41]、流感病毒[42－44]、HIV[45－47]等重要病毒的大规模关键宿主因子筛选，为宿主靶标的挖掘提供了非常重要的线索。

2.4 病毒－宿主相互作用中的宿主miRNA

miRNA作为重要的转录后调控因子参与到人体发育、细胞分化、增殖、凋亡及肿瘤发生等诸多生物学过程。到目前为止，已发现的人编码的miRNA前体已达721条。最近的研究表明，人编码的miRNA在病毒－宿主相互作用中也扮演着重要角色。挖掘病毒感染和致病依赖的宿主miRNA对以miRNA及其调控分子为靶的抗病毒药物设计具有重要的意义。宿主miRNA参与的病毒－宿主相互作用有多种模式。

首先，作为机体抗病毒免疫反应的重要补充，宿主编码的一些miRNA可以直接靶向病毒，并在病毒感染的早期发挥重要的抗病毒作用。Lecellier等[48]预测并证实了人类泡沫病毒基因组开放阅读框架2中的一个区域可能是人源miR－32的靶标，miR－32基因的表达可有效的抑制人类泡沫病毒的复制。研究还发现[49]过表达的miR－199a*可以显著的降低HCV－1b和HCV－2a的复制，并且其靶向的5'UTR区域在所有HCV基因型中是高度保守。Hariharan等[50]采用一致性得分的方法对靶向HIV的miRNA的进行了预测，发现了5种人源miRNA可以靶向病毒的关键基因，分别是:hsa－mir－29a 和 29b 可以靶向 nef 基因，hsa－mir－149 靶向vpr基因，hsa－mir－378 靶向 env 基因，hsa－mir－324－5p 靶向vif基因。这是首次报道可以靶向 HIV基因的人源miRNA的存在，它们可能在延缓HIV感染中起到非常重要的作用。

其次，病毒可以通过调节人源miRNA的表达可以广泛调节下游靶基因的表达水平，比如增加利于自身复制的聚合酶的表达，减少对自身不利免疫因子的表达。由于miRNA在转录水平即可发挥调控功能，因此病毒对宿主miRNA的调控有利于其实现对宿主细胞状态的快速、高效调节，这一作用模式可能广泛存在于各种病毒中，它的阐明对于理解病毒如何利用自身有限的基因组调节人体细胞复杂的调控网络具有重要意义。这种模式已经在HIV中得到了证实[51]，在 HIV 感染过程中，人源的 miR－17－5a和 miR－20a均被下调表达，从而导致两者在体内的靶标PCAF表达增加，而PCAF恰好是对HIV的感染有重要作用的Tat的辅助因子，使HIV的感染得到了增强。在病毒感染过程中常伴随着人体细胞中一系列基因的上调和下调，这些基因的产物又会影响其他基因的表达，最终引起细胞功能状态的改变。

此外，宿主miRNA可能与干扰素的抗病毒作用有密切关系。干扰素具有抗病毒的作用早已为人知晓，但其具体机制却仍然没有完全揭示，目前的研究认为干扰素是通过调节一系列细胞因子发挥抗病毒的作用[52－53]。Pedersen等[54]则发现干扰素的抗病毒作用与miRNA有密切关系，干扰素可引起人细胞内一系列miRNA的表达水平发生显著变化，其中5个miRNA在HCV的基因组中有相应的作用靶点，用它们的模拟物处理HCV感染细胞重现了干扰素作用的效果，而用反义寡核苷酸对干扰素产生的miRNA进行中和后则使干扰素的抗病毒效果显著降低。这些结果表明，干扰素可发动具有抗病毒作用的miRNA的表达而发挥直接的抗病毒作用，miRNA在干扰素作用机制中可能发挥着核心的作用，不过干扰素是否对其他病毒有类似的作用机制还有待于进一步的证实。

3 病毒－宿主分子相互作用网络分析

随着实验数据的快速积累，病毒－宿主分子相互作用呈现出越来越复杂的趋势，通过简单的逻辑分析很难把握这种复杂性。在此背景下，采用计算系统生物学方法构建和分析病毒－宿主分子相互作用网络、辨识病毒感染的关键宿主分子和通路成为重要的研究方向。

3.1 病毒－宿主分子相互作用的生物信息资源

在病毒－宿主分子网络方面的两个专业数据库是VirHostNet[55]和 VirusMINT[56]。另外，在病原微生物和宿主相互作用数据库 PHI－base[57]和 PHIDIAS[58]中，也包含了部分病毒－宿主分子相互作用数据。

VirHostNet是目前比较全面的综合性病毒－宿主分子相互作用数据库，其数据部分来自人工的文献挖掘和校对，部分来自其他相关数据库，内容包含了病毒自身蛋白质之间、病毒－宿主蛋白质之间及宿主自身蛋白质之间三部分的相互作用信息，共涉及7个病毒类、51个病毒科、222种病毒的1660个病毒蛋白。其中，病毒－人之间的蛋白相互作用共5207对，包含2189个人的蛋白和675个病毒蛋白，涉及31个病毒科、180种或亚种病毒。

通过对VirHostNet中收集的数据进行初步分析可以发现，当前对病毒的研究数据主要集中在双链DNA病毒、逆转录病毒、单链RNA病毒这三类病毒，其相关数据占数据库总数的90%以上;而对双链RNA病毒和Delta病毒的研究较少，相关数据仅占总数的0.3%。VirHostNet中的数据存在较大偏性，HIV，HCV，HPV，AAV，HB等被研究较多病毒的相关数据占了绝大多数，在进行大范围分析时需要进行统计学上的校正。

3.2 基于基因表达谱构建病毒感染激活网络

近年来，将动态的基因表达谱数据和静态的蛋白质相互作用网络进行整合分析的方法得到了快速发展，这种整合分析可以为蛋白相互作用网络加上时空约束，更加适合分析具体的生物医学问题。目前在 GEO[59]，ArrayExpress[60]等数据库中存储了大量病毒感染相关的基因表达谱数据，利用这些表达谱数据，结合人蛋白相互作用网络，可以通过计算手段快速构建病毒感染激活的宿主蛋白网络。

李非等[61]基于该思路提出了一种病毒感染激活子网构建方法，该方法融合了基因表达的差异性和相关性信息，采用了模拟退火迭代搜索算法，能够在已知的宿主蛋白质相互作用网络中辨识高功能相关度的病毒感染激活子网。该算法可以有效避免仅考虑基因表达差异性所引入的偏差，揭示了高相关性低表达差异基因在相关通路中的关键性作用。应用该算法构建HIV感染激活子网，经过4次迭代后，子网中有39%为文献报道的HIV相关分子，证明了算法的有效性。

3.3 大范围病毒－宿主蛋白相互作用网络分析

为了挖掘病毒－宿主蛋白相互作用网络中蕴含的一般规律，一些研究将各种代表性病毒和宿主的相互作用集成起来，在整体水平上考察病毒－宿主分子相互作用网络的各种性质。

Dyer等[62]通过对病毒－宿主蛋白相互作用网络的拓扑分析发现，与病毒感染密切相关的宿主蛋白多为网络中的“集线器(hub)分子”和“瓶颈(bottleneck)分子”。从复杂网络的角度看，这些结果预示病毒对宿主分子网络具有很强的影响乃至控制能力。从功能上看，病毒所涉及的宿主分子大多集中在细胞周期、细胞死亡、核转运等与病毒生活周期密切相关的通路上。Navratil等[62]对病毒－宿主蛋白相互作用网络的静态拓扑和虚拟扰动分析不仅得到了类似的结果，而且通过将病毒－宿主蛋白相互作用网络与疾病相关基因整合，发现了病毒感染和许多非传染病疾病之间的广泛联系。

4 挑战与展望

与病毒－宿主蛋白相互作用数据的积累相比，以此为对象的系统生物学研究工作还非常薄弱，已发表的结果大多是属性关联分析和静态拓扑分析，对病毒感染机制和宿主靶标发现的指导价值还不够。

病毒和宿主构成了复杂的生命体系，病毒的生存策略不仅体现在病毒－宿主蛋白相互作用网络的静态图谱上，更蕴含于这一高度时空依赖的复杂网络的动力学行为中。但目前对于病毒－宿主蛋白相互作用网络动态模型及其应用方面的研究还非常欠缺。从本质上讲，病毒蛋白与宿主蛋白发生相互作用取决于能否通过这种作用将网络从感染前的正常状态转换为感染后更有利于自身生存的疾病状态，而不取决于宿主蛋白在网络中的拓扑性质。与病毒蛋白直接作用的宿主蛋白表现出来的拓扑偏性是其动力学性质的一种折射。理想的宿主靶标应该是能够通过对其施加局部控制将网络由感染的疾病状态扭转为正常状态。因此，从系统生物学的角度看，宿主靶向抗病毒策略在本质上就是针对病毒－宿主蛋白相互作用网络的控制策略，而这种控制策略的获得必须基于对病毒－宿主蛋白相互作用网络动力学行为的深入揭示。

从最近报道的系统生物学研究进展上看，将动态模型引入分子相互作用网络可以得到一些对于药物开发具有重要指导意义的结果，这些工作将为病毒－宿主分子相互作用网络动态模型的构建和应用提供了重要参考，计算分析将在病毒－宿主相互作用研究和宿主靶标发现中发挥更加重要的作用。

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