Toll样受体在格林-巴利综合征发病机制中的作用

杜亚梅，张国军，马瑞敏，杨晓梅

Toll样受体在格林-巴利综合征发病机制中的作用

杜亚梅，张国军，马瑞敏，杨晓梅

格林-巴利综合征（Guillain-Barre syndrome，GBS）又称急性炎症性脱髓鞘性多发性神经根炎，是累及周围神经的自身免疫性脱髓鞘疾病，主要病理改变是脱髓鞘和炎性浸润。临床上呈急性或亚急性发病，以迅速进展的肢体无力、腱反射减弱、肌张力降低为特征，是世界范围内引起急性弛缓性瘫痪的常见病因。目前多认为是由感染等因素诱导、细胞及体液免疫共同介导的自身免疫性疾病，其确切发病机制尚未完全阐明。Toll 样受体（Toll like receptor，TLR）是一种模式识别受体，可以识别病原微生物的保守抗原分子，如脂多糖、肽聚糖等。Toll 样受体信号的过度活化可打破机体对自身抗原的免疫耐受，参与自身免疫性疾病的发生。近年来研究发现 Toll 样受体家族（TLRs ）在 GBS 发病及发展过程中具有重要作用。本文综述了 TLRs 及其信号通路在 GBS 发病机制中的作用，重点介绍 TLR2,4,9 在GBS 发病机制中的作用。

1 GBS 的发病机制

1.1 前驱感染及抗神经节苷酯抗体

约 2/3 GBS 患者在发病前 1 ～ 4 周曾有感染[1]，感染的微生物主要包括弯曲杆菌、EB 病毒、巨细胞病毒、HPV等，最常见的为空肠弯曲杆菌。Kokubun 等[2]研究结果显示弯曲杆菌感染与急性轴索型 GBS 关系密切。空肠弯曲杆菌在分子结构上与人类周围神经的神经节苷酯表位之间具有分子模拟现象，从而导致机体对两者的交叉反应，产生自身抗体，形成攻膜复合物，导致周围神经髓鞘变性损伤。我国是 GBS 病前感染弯曲杆菌的高发国家，国内急性运动性轴索型 GBS（即 AMAN 型 GBS）患者血清抗弯曲杆菌抗体阳性率为 91.4%[3]，是我国 GBS 发病的主要病因。

在 GBS 发病过程中，机体识别病原菌后发生交叉反应产生自身抗体，即抗神经节苷酯抗体，约 60% GBS 患者抗神经节苷酯抗体阳性[4]。Yuki 等[5]对 55 例中国 GBS 患者（9 例 AIDP、28 例 AMAN、18 例不能分类）检测了抗神经节苷酯抗体，发现中国 GBS 患者弯曲杆菌感染阳性率与抗神经节苷酯抗体显著相关。这表明抗神经节苷酯抗体的产生与空肠弯曲杆菌的前驱感染有一定相关性，与 GBS 的发病相关。

1.2 细胞免疫与细胞因子

GBS 是 Th1 细胞介导的自身免疫性疾病[6]。GBS 患者坐骨神经病理学检查显示神经周围有大量淋巴细胞及巨噬细胞浸润。这表明淋巴细胞、巨噬细胞在 GBS 患者发病过程中具有重要作用。巨噬细胞迁徙抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一种淋巴细胞激活因子，可以抑制巨噬细胞的广泛迁徙，有助于巨噬细胞在炎症局部发挥作用。Wang 等[7]分离 GBS 患者外周血单个核细胞在体外培养，抑制 MIF 表达后，寡糖脂（lipo-oligosaccharide，LOS）上调 TLR4 的表达量降低，细胞因子的产生量也减低。表明巨噬细胞在 GBS 发病过程中也起到重要作用。

炎性细胞是细胞因子（cytokine，CK）的主要来源，因此，CK 可能也参与了对雪旺细胞、髓鞘、轴索的损害。参与 GBS 发病的 CK 主要包括：IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-6等。这些细胞因子发挥作用的机制主要包括：①诱导 B 细胞增殖、分化产生抗体；②可诱导巨噬细胞表面 MHC-II 类抗原的表达，促进巨噬细胞产生能直接破坏髓鞘的氧自由基和其他毒性物质；③损伤内皮细胞增加血管通透性，破坏血-脑脊液屏障，允许炎性细胞通过血-脑神经屏障，启动免疫介导的脱髓鞘疾病[8]。

目前，关于 GBS 的发病机制研究主要是关于细胞因子及自身抗体，但这些免疫机制的信号启动及传导是如何进行的仍然不清楚。TLR 家族作为一类病原识别受体，其与GBS 发病的关系成为了研究热点。

2 Toll 样受体及其信号通路

2.1 TLRs 结构

TLRs 是参与非特异性免疫（天然免疫）的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁，现已发现 11 种人源 TLRs[9]，主要分布于免疫细胞及与外界相通的腔道上皮细胞表面，在巨噬细胞、树突状细胞等专职抗原提呈细胞表面的表达尤其丰富。TLRs 通过识别相应的配体激活机体产生免疫应答，在多种疾病的发生及进展中有着重要作用[10]。

TLRs 为 I 型跨膜蛋白，胞外区均有 19 ～ 25 个富含亮氨酸的重复序列（LRR 模体）XLXXLXLXX（X 代表任何氨基酸，L 为亮氨酸），每个 LRR 形成一个马蹄型的结构，可以特异性地识别相关抗原。

2.2 TLRs 配体及信号传导途径

TLRs 的配体分为外源性配体及内源性配体。外源性配体主要为病原微生物的保守成分，如脂多糖、肽聚糖；内源性配体主要为机体细胞破坏过程中产生的分子，如热休克蛋白、细胞外基质降解成分等。不同的 TLR 可以识别不同的配体，例如 TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 的配体分别为肽聚糖[11]、脂多糖[12]、鞭毛蛋白[13]、CpG-DNA[14]。

TLRs 识别相应配体后通过髓样分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖途径及 MyD88 非依赖途径进行信号转导。TLR2,9 主要通过 MyD88 依赖途径进行信号传导，TLR4 可以通过两种信号途径进行信号传导[15]。TLR 识别抗原之后通过信号转导途径使得下游的信号分子核因子-κB（nuclear factor，NF-κB）表达量增多、活性增强，最终导致炎性因子的表达量增多，从而出现一系列的病理改变及临床症状。

2.3 TLRs 的作用

由于 TLRs 识别的是微生物的保守成分，在微生物侵入的早期启动天然免疫，通过吞噬、清除作用对人体起到保护作用，因此早期人们认为 TLRs 的主要作用是参与天然免疫，并不具有免疫特异性及记忆性特征。之后随着研究的不断深入，发现 TLRs 也能够特异性识别抗原，并且进一步调控机体免疫反应。

TLRs 最主要的生物学功能是促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应。单核巨噬细胞、树突状细胞等细胞膜表面的 TLRs 识别相应配体后，经由胞内信号传导通路，最终由进入胞核内的 NF-κB 启动核内相关基因，转录出mRNA，促进 IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ 等的表达并释放到细胞外引起相应炎症反应[16]。除此之外，TLR 还可以促进免疫细胞成熟[17]；介导自身反应性 B 细胞产生IgG 的自身抗体导致细胞发生凋亡，从而可降低过度的免疫应答，参与获得性免疫应答的调节[18]、抗病毒感染[19]等作用。

TLRs 与自身免疫性疾病的发病也有一定的关系，如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、自身免疫性肝病（autoimmune liver disease，AILD）。Komatsuda等[20]通过检测 SLE 患者外周血单个核细胞 TLR7 mRNA、TLR9 mRNA 表达量，发现明显高于正常对照组。Nakamura等[21]发现 AILD患者 TLR3 表达量明显高于健康对照。这表明 TLRs 通过一定的方式参与自身免疫性疾病的发病。

3 TLRs 在 GBS 发病机制中的作用

近年来，越来越多的研究表明 TLRs 在 GBS 的发病过程中起重要作用，其中 TLR2,4,9 受到了广泛关注。

3.1 TLRs 与实验性自身免疫性神经炎

实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis，EAN）是 GBS 的理想动物模型[22]。在小鼠 EAN模型中，TLR2 在发生炎性损伤的组织中高表达，TLR2 信号传导通路中的 NF-κB 在激活的 T 细胞、雪旺细胞、巨噬细胞中高表达，并且随着症状的加重，表达量不断升高直到病情达顶峰[23]。为证实 TLR2 在 EAN 发病中的作用，有人做了进一步研究，对 TLR2 基因缺失的小鼠进行神经相关性自身免疫性疾病造模，结果很少小鼠可以造模成功[24]，证明 TLR2 基因缺失会使小鼠对神经相关性自身免疫性疾病产生抵抗。这表明 TLR2 对于 EAN 的发病至关重要，参与的方式可能是通过识别相应抗原、传递 T 细胞共刺激信号、促进 T 细胞增殖[25]等。

除了 TLR2 与 EAN 发病密切相关外，EAN 小鼠TLR4,9 表达量也升高。Deng 和 Zhou[26]使用周围神经蛋白Po 蛋白 180 ～ 199 肽段免疫小鼠构建 EAN 模型后，发现小鼠坐骨神经、脾细胞、外周血单个核细胞 TLR4,9 的表达量在 16 周达高峰，之后随症状的减轻表达量减低，至症状很轻微时，表达量仍然高于对照组。表明 TLR4,9 与EAN 的发病相关，并与疾病严重程度具有相关性。为进一步研究 TLR9 与 EAN 的关系，给症状达顶峰的 EAN 小鼠分别注射 TLR9 的抑制剂 sODN（suppressive ODNs）及不具有功效的对照非特异性 ODN（non-specific ODN，nODN），注射 sODN 的小鼠与对照组相比，TLR9 表达明显降低并且症状明显减轻[27]。表明 TLR9 在 EAN 的发病过程中同样具有重要作用。

3.2 TLRs 与 GBS

GBS 患者大多具有前驱感染，主要致病菌为空肠弯曲杆菌，被认为是由于分子模拟导致的疾病[28]。TLR4 是空肠弯曲杆菌主要致病成分的识别受体，TLRs 的许多其他成员也是识别致病菌的主要受体，因此 TLRs 是否参与 GBS的发病就受到了广泛的关注。Wang 等[29]通过对 21 例格林-巴利患者研究发现，TLR2,4,9 mRNA 含量及蛋白表达量明显高于健康对照，并且与疾病严重程度相关，而对 TLR 具有负调节作用的细胞因子信号抑制剂-1（suppressors of cytokine signaling，SOCS-1）和 SOCS-3 mRNA 表达量明显低于对照组。这表明 TLR2,4,9 与 GBS 的发病可能相关。同时对外周血单个核细胞进行培养，培养时分别加入TLR2,4,9 的刺激物，结果细胞培养上清液中细胞因子IFN-γ 的含量明显高于健康对照。这个结果进一步表明TLR2,4,9 激活后可以产生大量与 GBS 发病相关的细胞因子，是 GBS 发病的重要环节。Gries 等[30]也做了类似的研究，结果显示，GBS 患者外周血单个核细胞 TLR2,4,6 mRNA 与 GBS 明显相关，但与 GBS 的疾病严重程度无关。TLRs 与 GBS 的严重程度到底是否相关还需要进一步研究。为了深入研究 TLRs 与 GBS 的关系，Kuijf 等[31]分离出 GBS 患者人外周血中的树突状细胞（DC）进行培养，培养时加入抗 TLR4 mAb 及 TLR4 刺激物 LOS，结果 IL-10、IL-6、IL-8、TNF-α 的产生量明显降低。之前有研究者给红斑狼疮小鼠注射抑制 TLR7 和 TLR9 的寡脱氧核苷酸序列（ODN），发现抗核抗体产生减少，狼疮性肾炎减轻，生存期明显延长[32]。这为以 TLRs 为靶点对 GBS进行治疗提供了理论依据。

关于 TLRs 如何参与 GBS 发病也有许多研究，我们认为主要是通过以下方式：TLRs 识别抗原后，通过 MyD88依赖途径和（或）MyD88 非依赖途径进行信号传导，活化抗原递呈细胞，主要为巨噬细胞，之后活化 T 细胞，主要促进 Th1 细胞生成，导致 Th1 与 Th2 不平衡[33]。Th1 细胞主要作用于巨噬细胞，促进其释放炎症因子，产生的细胞因子主要作用于坐骨神经、淋巴器官等处，介导对周围神经的炎性损伤[34]。Th2 细胞产生的细胞因子与疾病的恢复有关。通过以上几个过程的相互作用，最终患者出现脱髓鞘及炎性浸润等病理表现。

4 结语

总之，TLRs 在 GBS 发病中具有重要作用。但目前对于 TLRs 与 GBS 发病关系研究尚不足，主要研究的是TLRs 与 GBS 的关系，对 TLRs 参与 GBS 发病的机制没有深入的研究。因此，在 TLRs 及其信号通路参与 GBS 发病机制等方面仍有大量工作尚待展开。深入研究 TLRs 及其信号通路在 GBS 发病中的作用不仅可以加深对 GBS发病的认识，也将为 GBS 的治疗提供新的思路、新的靶点。

[1] Vucic S, Kiernan MC, Cornblath DR. Guillain-Barré syndrome: an update. J Clin Neurosci, 2009, 16(6):733-741.

[2] Kokubun N, Shahrizaila N, Koga M, et al. The demyelination neurophysiological criteria can be misleading in Campylobacter jejuni-related Guillain-Barré syndrome. Clin Neurophysiol, 2013, 124(8):1671-1679.

[3] Li CY, Chen JJ, Zhang JZ, et al. Acute motor axonal neuropathy-the analysis of 121 serum anti campylobacter jejuni antibodies. Hebei Med J, 1993, 15(2):134-136. (in Chinese)

李春岩, 陈晶晶, 张建中, 等. 急性运动性轴索性神经病——121份血清抗空肠弯曲菌抗体分析. 河北医药, 1993, 15(2):134-136.

[4] Yu RK, Usuki S, Ariga T. Ganglioside molecular mimicry and its pathological roles in Guillain-Barré syndrome and related diseases. Infect Immun, 2006, 74(12):6517-6527.

[5] Yuki N, Ho TW, Tagawa Y, et al. Autoantibodies to GM1b and GalNAc-GD1a: relationship to Campylobacter jejuni infection and acute motor axonal neuropathy in China. J Neurol Sci, 1999, 164(2): 134-138.

[6] Burns TM. Guillain-Barré syndrome. Semin Neurol, 2008, 28(2):152-167.

[7] Wang YZ, Tian FF, Liu H, et al. Macrophage migration inhibitory factor is necessary for the lipo-oligosaccharide-induced response by modulation of Toll-like receptor 4 in monocytes from GBS patients. J Neuroimmunol, 2013, 257(1-2):67-75.

[8] Lu MO, Zhu J. The role of cytokines in Guillain-Barré syndrome. J Neurol, 2011, 258(4):533-548.

[9] Hans M, Hans VM. Toll-like receptors and their dual role in periodontitis: a review. J Oral Sci, 2011, 53(3):263-271.

[10] Ma RM, Zhang GJ, Kang XX. Advances in studies on the relationship between Toll like receptors and autoimmune diseases. J Capital Med Univ, 2012, 33(2):177-181. (in Chinese)

马瑞敏, 张国军, 康熙雄. Toll样受体与自身免疫性疾病关系的研究进展. 首都医科大学学报, 2012, 33(2):177-181.

[11] Eom SH, Gu GJ, Suh CW, et al. Suppression of inducible nitric oxide synthase expression induced by Toll-like receptor agonists by (E)-1-(2-(2-nitrovinyl)phenyl)pyrrolidine. Int Immunopharmacol, 2013, 17(2):205-209.

[12] Santaolalla R, Sussman DA, Ruiz JR, et al. TLR4 activates the β-catenin pathway to cause intestinal neoplasia. PLoS One, 2013, 8(5): e63298.

[13] Hajam IA, Dar PA, Sekar SC, et al. Expression, purification, and functional characterisation of flagellin, a TLR5-ligand. Vet Ital, 2013, 49(2):181-186.

[14] Hilbert T, Bongartz J, Weisheit C, et al. Beta2-adrenoceptor stimulation suppresses TLR9-dependent IFNA1 secretion in human peripheral blood mononuclear cells. PLoS One, 2013, 8(5):e65024.

[15] O’Neill LA. When signaling pathways collide: positive and negative regulation of toll-like receptor signal transduction. Immunity, 2008, 29(1):12-20.

[16] Arbour NC, Lorenz E, Schutte BC, et al. TLR4 mutations are associated with endotoxin hyporesponsiveness in humans. Nat Genet, 2000, 25(2):187-191.

[17] Hertz CJ, Kiertscher SM, Godowski PJ, et al. Microbial lipopeptides stimulate dendritic cell maturation via Toll-like receptor 2. J Immunol, 2001, 166(4):2444-2450.

[18] Leadbetter EA, Rifkin IR, Hohlbaum AM, et al. Chromatin-IgG complexes activate B cells by dual engagement of IgM and Toll-like receptors. Nature, 2002, 416(6881):603-607.

[19] Kurt-Jones EA, Popova L, Kwinn L, et al. Pattern recognition receptors TLR4 and CD14 mediate response to respiratory syncytial virus. Nat Immunol, 2000, 1(5):398-401.

[20] Komatsuda A, Wakui H, Iwamoto K, et al. Up-regulated expression of Toll-like receptors mRNAs in peripheral blood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol, 2008, 152(3):482-487.

[21] Nakamura M, Funami K, Komori A, et al. Increased expression of Toll-like receptor 3 in intrahepatic biliary epithelial cells at sites of ductular reaction in diseased livers. Hepatol Int, 2008, 2(2):222-230.

[22] Gold R, Hartung HP, Toyka KV. Animal models for autoimmune demyelinating disorders of the nervous system. Mol Med Today, 2000, 6(2):88-91.

[23] Zhang ZY, Zhang Z, Schluesener HJ. Toll-like receptor-2, CD14 and heat-shock protein 70 in inflammatory lesions of rat experimental autoimmune neuritis. Neuroscience, 2009, 159(1):136-142.

[24] Reynolds JM, Pappu BP, Peng J, et al. Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease. Immunity, 2010, 32(5):692-702.

[25] Mercier BC, Cottalorda A, Coupet CA, et al. TLR2 engagement on CD8 T cells enables generation of functional memory cells in response to a suboptimal TCR signal. J Immunol, 2009, 182(4):1860-1867.

[26] Deng YN, Zhou WB. Expression of TLR4 and TLR9 mRNA in Lewis rats with experi-mental allergic neuritis. Neuroimmunomodulation, 2007, 14(6):337-343.

[27] Wang YZ, Liang QH, Ramkalawan H, et al. Inactivation of TLR9 by a suppressive oligodeoxynucleotides can ameliorate the clinical signs of EAN. Immunol Invest, 2012, 41(2):171-182.

[28] Ang CW, Jacobs BC, Laman JD. The Guillain-Barré syndrome: a true case of molecular mimicry. Trends Immunol, 2004, 25(2):61-66.

[29] Wang YZ, Liang QH, Ramkalawan H, et al. Expression of Toll-like receptors 2, 4 and 9 in patients with Guillain-Barré syndrome. Neuroimmunomodulation, 2012, 19(1):60-68.

[30] Gries M, Davies L, Liu Y, et al. Response of Toll-like receptors in experimental Guillain-Barré syndrome: a kinetic analysis. Neurosci Lett, 2012, 518(2):154-160.

[31] Kuijf ML, Samsom JN, van Rijs W, et al. TLR4-mediated sensing of Campylobacter jejuni by dendritic cells is determined by sialylation. J Immunol, 2010, 185(1):748-755.

[32] Barrat FJ, Meeker T, Chan JH, et al. Treatment of lupus-prone mice with a dual inhibitor of TLR7 and TLR9 leads to reduction of autoantibody production and amelioration of disease symptoms. Eur J Immunol, 2007, 37(12):3582-3586.

[33] Zhu J, Bai XF, Mix E, et al. Cytokine dichotomy in peripheral nervous system influences the outcome of experimental allergic neuritis: dynamics of mRNA expression for IL-1 beta, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-alpha, TNF-beta, and cytolysin. Clin Immunol Immunopathol, 1997, 84(1):85-94.

[34] Heusinkveld M, de Vos van Steenwijk PJ, Goedemans R, et al. M2 macrophages induced by prostaglandin E2 and IL-6 from cervical carcinoma are switched to activated M1 macrophages by CD4+ Th1 cells. J Immunol, 2011, 187(3):1157-1165.

我会参与发起成立“中国疫苗免疫社会组织联盟”

为促进社会组织在疫苗免疫与全球卫生事业发展中发挥积极作用，加强同政府部门、私有企业、国际社会建立沟通合作纽带，11 月 8 日，由中华预防医学会牵头，我会等 8 家学协会共同倡议发起成立“中国疫苗免疫社会组织联盟”（英文名China Alliance of CSOs for Vaccine Immunization，CACVI，以下简称“联盟”）。联盟成员将以“共同倡导政府、企业和社会协调合作，坚持预防为主的方针，共同建立产学研用科技创新平台，共同开展疫苗相关新技术的研发、新产品的推广和应用，促进疫苗免疫领域的公共健康教育科普宣传，提高弱势群体免疫接种服务可及性”为使命，为实现“全民健康覆盖”的美好愿景发挥应有的作用，共同推动中国乃至全球的疫苗免疫事业不断向前发展。

合肥市招商局到访协会

11 月 7 日，合肥市招商局梁峰副局长一行 6 人到访协会。吴朝晖秘书长首先对一行人的到访表示欢迎，并介绍了协会的情况。

合肥巢湖经济开发区招商局黄治斌局长介绍了开发区情况，合肥巢湖经济开发区是 2004 年经国务院核准保留的省级开发区，现为合肥市直管的四大开发区之一。开发区规划面积 61 平方公里，功能结构合理，已经形成集半汤综合城区、花山工业园区、半汤国际温泉度假区和高铁片区四大片区的布局。开发区集聚了北大未名、方良生物科技、今辰药业等生物科技企业，围绕生物医药、生物环保、生物农业、生物能源、生物制造、生物服务六大领域进行重点打造。

了解到协会每两年举办一次中国医药生物技术论坛，梁峰副局长表示希望 2015 年的论坛能够在合肥举办，并欢迎我会的广大会员落户合肥巢湖经济开发区，双方共期在今后能有进一步的合作。

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.06.012

首都医科大学基础临床合作课题；北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养项目

100050 北京，首都医科大学附属北京天坛医院检验科（杜亚梅、张国军、马瑞敏）；100069北京，首都医科大学生物化学与分子生物学系（杨晓梅）

张国军，Email：tiantanzgj@163.com

2013-09-03