我国猪瘟病毒基因流行变异研究

郝 飞 汤德元＊ 曾智勇 李春燕

罗险峰2 甘振磊1 刘 建1 王洪光1

（1贵州大学动物科学学院，贵州省贵阳市 550025；2贵州省动物疫病预防控制中心，贵州省贵阳市 550008）

猪瘟 （Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒 （Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种以高热、出血和高死亡率为特征的接触性传染病[1]。可感染各种年龄和品种的猪只[2]，是危害全球养猪业的重要传染病，被世界卫生组织（OIE）列入必须申报的动物传染病目录，我国将其列为一类动物传染病。在我国广泛地应用猪瘟兔化弱毒疫苗免疫后，猪瘟的发生和流行得到了有效的控制。近年来，我国的猪瘟疫情有反弹趋势，因此了解猪瘟病毒疫苗毒与流行毒株之间的差异，对于猪瘟的防制十分重要。目前，我国对猪瘟病毒的流行病学研究主要集中在对流行毒株基因群 （基因亚群）的划分和对猪瘟病毒主要保护性抗原基因 （E0、E2基因）的变异分析。因此，猪瘟病毒基因流行变异情况的研究对于我国猪瘟的防制乃至净化有着重要的意义。

1 猪瘟的基因分群

国际上将猪瘟病毒分为3个基因群，即基因Ⅰ群 （GroupⅠ）、基因Ⅱ群（GroupⅡ） 和基因Ⅲ群 （GroupⅢ）， 在这3个大群下面又细分了10个基因亚群，分别为 1.1亚群 （Subgroup 1.1）、1.2亚群 （Subgroup 1.2）、 1.3亚群（Subgroup 1.3）、 2.1 亚群 （Subgroup 2.1）、 2.2 亚群 （Subgroup 2.2）、 2.3 亚群 （Subgroup 2.3）、 3.1亚群 （Subgroup 3.1）、 3.2 亚群 （Subgroup 3.2）、 3.3 亚群 （Subgroup 3.3） 和3.4亚群 （Subgroup 3.4）[3]。我国猪瘟病毒流行毒株主要分为CSFV基因Ⅰ群和基因Ⅱ群，且以基因Ⅱ群为主，各流行毒株亚群分布介于Subgroup 1.1、Subgroup 2.1、Subgroup 2.2和Subgroup 2.3亚群，占主导地位的是Subgroup 2.1和Subgroup 2.2。20世纪分离的标准强毒株Shimen株及以其为母本致弱的兔化弱毒株HCLV株均属Subgroup 1.1。到目前为止，我国尚未有Subgroup 1.2、Subgroup 1.3和基因Ⅲ群毒株的报道。

1.1 CSFV E2基因分群

猪瘟病毒E2基因参与病毒对细胞的感染过程，携带能刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇，E2蛋白是猪瘟病毒的主要保护性抗原。研究E2基因和蛋白的变异对制定猪瘟防控策略具有十分重要的意义。王琴等[4]在对不同时期分离到的12株猪瘟毒株的E2基因主要抗原区域序列研究时发现，20世纪80年代到90年代在我国流行的猪瘟病毒在基因Ⅰ群和Ⅱ群均有分布，其中属Ⅰ群的有1株20世纪80年代的野毒株和5株20世纪90年代的野毒株，属Ⅱ群的有6个野毒株 （20世纪80年代与90年代的野毒株各3株）。赵耘等[5]将获得的16株猪瘟病毒的E2基因主要抗原编码区序列进行分析发现Shimen株和C株同属Ⅰ群中的Subgroup 1.1；4株20世纪70年代到80年代的分离株有1株属于Ⅰ群的Subgroup 1.1，其余3株均属于Ⅱ群的Subgroup 2.1；10株20世纪90年代的分离株有5株属于I群中的Subgroup 1.1，4株属于 Subgroup 2.1，l株属于Subgroup 2.2。测定的14个流行株有6株属Ⅰ群，占42.9%，8株属Ⅱ群，占57.1%。吴健敏等[6]从广西8个地市13个发病猪场采集的疑似猪瘟病料中扩增并测定了CSFV基因部分序列，进化树分析表明，广西的猪瘟病毒流行株基因群分布于2个基因群的4个亚群 （即Subgroup 1.1、Subgroup 2.1、Subgroup 2.2和Subgroup 2.3），其中交通不发达的边远地区流行毒株以Ⅰ群中的Subgroup 1.1为主，而交通发达地区流行毒株以Ⅱ群为主。说明我国猪瘟流行毒株存在明显的遗传多样性和明显的地域特征。涂长春[7]测定了全国30个省、市、自治区191个猪瘟病毒流行株E2基因片段，结果发现这191株猪瘟病毒流行毒株分为2个基因群，基因Ⅰ群毒株占26%，基因Ⅱ群占74%。在主要流行的基因Ⅱ群毒株中，以Subgroup 2.1为主，Subgroup 2.2和Subgroup 2.3的流行态势较弱。我国流行的所有Ⅰ群毒株均为Subgroup 1.1，而且大部分毒株与Shimen株序列同源性很高，推测其可能是在中国流行几十年的本土病毒。但在这些序列中未发现基因Ⅲ群毒株，表明在周边国家，如韩国和泰国等地区流行的基因Ⅲ群毒株尚未传入我国。

1.2 CSFV E0基因分群

E0基因 （Erns基因）在猪瘟病毒对细胞的感染及在细胞中的复制、表达和调控中起着重要作用。其编码的E0蛋白是猪瘟病毒结构蛋白中唯一能够分泌到侵染细胞培养上清液中的囊膜糖蛋白，具有诱导机体产生中和抗体的能力，同时具有RNA酶活性，能降解病毒和细胞的RNA，还可导致免疫抑制，是猪瘟病毒的毒力蛋白和保护性抗原。刘湘涛等[8]对5株1997～1998年间甘肃省猪瘟流行毒株和l株猪瘟兰州C株弱毒疫苗毒E0基因进行序列测定，结果表明5株流行毒株均属于基因Ⅱ群。王琴等[9]对10个猪瘟野毒株、4批不同厂家生产的兔化弱毒疫苗株及1个标准Shimen株E0基因的序列进行系统发生树分析，结果表明这些毒株分为Ⅰ和Ⅱ两大基因群及4个亚群，间接说明我国猪瘟病毒的变异呈现一定多样性。

2 猪瘟病毒流行变异研究

猪瘟病毒的基因变异决定了其遗传多样性，为了进一步探明其变异规律，进而明确导致毒株分群的氨基酸变异位点，国内许多学者对我国猪瘟病毒的分子流行病学现状进行了遗传衍化分析。

2.1 CSFV E2基因流行变异研究

李红卫等[10]首先在国内开展了猪瘟病毒标准强毒弱毒株和少数流行株E2基因序列的测定与比较，对国内3个兽医生物制品厂提供的猪瘟病毒兔化弱毒株E2基因保护性抗原编码区序列进行研究，并与国内Shimen株和国外C株相同区域进行同源性比较，发现不同来源的C株和Shimen株之间存在不同程度的差异，从而推测不同来源C株的抗原表位存在差异，最终可能会导致免疫效果不同。王宁等[11]研究发现Shimen株与国内使用的疫苗毒株同源性最低，说明国内疫苗毒株的E2基因在生产中存在较大变异，可能导致抗原漂移。刘伯华等[12]对6株甘肃省猪瘟流行野毒及C株细胞疫苗毒E2基因的核苷酸序列进行分析，结果表明流行野毒与C株在中和抗原决定簇上有部分氨基酸存在性质差异，可能影响C株对流行野毒的中和滴度，但也有学者持相反的观点。王琴等[4]对12株猪瘟病毒E2基因主要抗原区域的序列差异进行了分析，初步证明我国应用的疫苗株HCLV是稳定的。利用目前我国流行的部分野毒株对HCLV株免疫猪攻毒试验显示，免疫猪只对野毒株具有较高抵抗力，与序列分析结果相吻合，表明了HCLV株E2基因主要编码区没有发生关键的变异。韩雪清等[13]研究发现C株兔化组织毒适应异种细胞后其抗原区的变异很小甚至没有变异，经常发生的C株细胞毒疫苗免疫失败现象可能并非由疫苗毒抗原基因漂移所致。

涂长春[5]对3个基因型共9个亚型的177个序列进行分析时发现了如下规律：在基因组E2蛋白编码区内，第734位Lys(K)→Arg(I)，723位Ser(S)→Asn(N)，745位 Thr(T)→Ile(I)导致Subgroup 2.1的出现，738位Thr(T) →Ile(I)导致Subgroup 2.2的出现，736位Ile(I)→Val(V)导致Subgroup 2.3的出现，725位Gly(G)→Asp(D)， 729位 Asp(D)→Asn(N)，738位Thr(T)→Val(V)导致Subgroup 1.1的出现。赵耘等[14]对22株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的分析表明，我国猪瘟病毒流行毒株向着远离疫苗株的方向变异，且呈现一定多样性。李明晖等[15]对4株甘肃省1997～1998年间流行毒株的E2基因序列分析表明，CSFV流行毒株与C株的E2蛋白之间存在一定的差异。邓雨修等[16]扩增了3株广东省近年来流行的猪瘟病毒E2基因，发现与Shimen株同源性为82.3%～93%，表明近年来猪瘟流行毒株的变异呈现一定的多样性。杨林等[17]研究发现黑龙江省6株猪瘟流行株均为经典毒株，与HCLV、Shimen毒株E2基因核苷酸同源性分别为92.4%～95.5%、92.6%～96.1%，氨基酸同源性分别为 90.7%～95.0%、91.9%～96.3%。马秋明等[18]研究发现陕西省l0株猪瘟流行毒株与Shimen株和HCLV疫苗株E2基因主要抗原区的核苷酸同源性为75.0%～79.4%，氨基酸同源性为77.8%～84.4%，说明陕西省猪瘟流行株发生了较大变异。以上研究表明，我国广西地区的CSFV流行毒株E2基因也呈现较为明显的变异。

综上表明，我国不同地区猪瘟流行毒株的差异情况较为复杂，主要趋向于远离疫苗株变异，同时又存在和Shimen株等同源性较高的经典毒株流行。

2.2 CSFV E0基因流行变异研究

李红卫等[19]研究发现从第480代猪瘟兔化弱毒株 （HCLV）脾毒中扩增出的E0基因与C株相应序列的核苷酸、氨基酸序列同源性分别为99.1%和98.4%。王家富等[20]研究发现中国兽药监察所第482代兔化脾组织毒（HCLV）和Shimen强毒株E0基因序列核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为95.0%和94.3%，HCLV株比Shimen株多了一个潜在的N-糖基化位点，且有13个氨基酸的差异。龚振华等[21]将流行株XN株的E0基因分别与 Shimen、C株相应序列进行比较，发现他们的核苷酸同源性分别为99%和95%。

E0糖蛋白有4个保守区域，氨基酸位点分别为21～43位、71～94位，123～141位、154～182位。其中28～40位，71～89位的氨基酸是 E0糖蛋白RNase活性区（催化活性的氨基酸为His30、His79）。对多株毒株研究表明，E0糖蛋白第107位氨基酸变异较大，HCLV株为Val，Brescia株为Set，Shimen株和ALD株为Ala，GPE株和Alfort株为Asp，推测该位置氨基酸的高度变异可能与其抗原决定簇的特异性有关。刘湘涛等[8]对猪瘟流行毒株E0基因的遗传变异进行了研究，完成了1997～1998年间5株猪瘟流行毒株和1株C株E0基因的核酸序列测定。序列分析表明这5株流行毒株与C株的核苷酸同源性为83%～84%，流行毒株与疫苗株之间有较大差异，而5株流行毒之间的核苷酸同源性为91%～98%，差异较小。在RNase活性基序中，C株和5株流行毒株有一个氨基酸存在差异，C株含不带电荷的Gly(G)，5株流行毒株均含 Glu(E)，经典强毒株 SM、A1fort、Brescia株和P97株也都含 Glu(E)，但这一差异对催化活力有无影响尚不明确。王琴等[9]将10株猪瘟野毒株、4批不同厂家生产的猪瘟兔化弱毒疫苗株和1个标准猪瘟SM株进行E0基因序列同源性比较分析，结果表明15株毒株 E0基因核苷酸同源性为83.0%～100%，氨基酸同源性为87.9%～100%。4批兔化弱毒疫苗株相对稳定，仅存在1～2个氨基酸残差异。15株毒株E0基因具有RNase活性的2个区域SLHGlWPG(E)和EWNKHGWC均十分保守，但疫苗毒SLHGIWPE基序中的E替换为G，而基序中His30、His79催化活性关键氨基酸残基高度保守，均未发生变异。

由此可见，我国猪瘟病毒流行毒株主要分为猪瘟病毒基因Ⅰ群和基因Ⅱ群，且以基因Ⅱ群为主，通过对猪瘟病毒E0基因序列分析表明，流行株与疫苗株相比虽然发生了一定程度的变异，但是在RNase活性关键位点高度保守，未出现变异，而通过对E2基因序列分析表明，我国猪瘟病毒的流行毒株正在向远离猪瘟兔化弱毒疫苗株 （HCLV株）方向变异。

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