蛋白质组学在肺癌研究中的应用进展

张蕾，张福营，赵婷，凌人，丛维涛，金利泰

蛋白质组学（proteomics）指的是在大规模水平上研究细胞内动态变化的蛋白质的翻译后修饰、组成与表达水平，探究蛋白质之间的相互作用，揭示蛋白质功能与细胞活动规律的学科。蛋白质组学技术主要包括蛋白质的分离、质谱鉴定及生物信息学等技术。

肺癌是临床最常见的恶性肿瘤，也是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。目前肺癌患者总体 5 年生存率只有 15%，但早期诊断出的肺癌患者 5 年生存率可达 85%，因此早期筛查是肺癌防治的关键。由于肺癌早期症状不明显，传统的临床诊断方式难以实现早期诊断。应用蛋白质组学方法分析肺癌细胞株、肺癌组织，或肺癌血清、血浆中表达的全部蛋白质，通过与正常肺细胞或健康人的蛋白质组对比分析，筛选差异蛋白，寻找灵敏度高、特异性强的肺癌标记物，可为肺癌发病机制研究提供理论依据，为肺癌的预防、早期诊断和治疗方法提供新的途径。本文就近年来肺癌的蛋白质组学研究进展进行综述，并对其前景进行展望。

1 肺癌细胞的蛋白质组学研究

通过体外实验，比较肺癌细胞和正常细胞的蛋白质组学差异、分析蛋白质功能，能够间接揭示肺细胞癌的产生和转移机制。

詹显全等[1]对 A549 和正常细胞系 HBE 进行了蛋白质组学研究，鉴定出 18 种差异蛋白，经肽质指纹分析，发现这些蛋白与细胞信号转导、细胞代谢、增殖、分化有关。另外，李丽萍等[2]运用双向凝胶电泳（2-DE）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）法也筛选出 A549 和 HBE 间表达水平显著差异的 21 个蛋白，并证实在肺腺癌 A549 细胞中高表达热休克蛋白 27（HSPB1）可能在肺腺癌癌变过程中发挥重要作用。这些差异蛋白将可能作为肺癌早期诊断的靶向标记物。

Chang 等[3]也鉴定出 A549 和人正常细胞间的 8 个差异表达蛋白质，其中过氧化物氧化还原酶 1（peroxiredoxin 1）在肺肿瘤组织中高表达，因此 peroxiredoxin 1 可作为潜在的肿瘤标记物和肺癌药物治疗的靶点。Ying 等[4]对原代细胞 R15H 和经238Pu 高能量 α 粒子照射 HPV-18 永生化人支气管上皮细胞 BEP20 得到早期传代细胞 R15H20，用蛋白质组学技术分析，发现两种细胞中有 43 个差异蛋白质，R15H20 与 R15H 相比，21 种蛋白表达增加，22 种蛋白表达减少。仅在 R15H 细胞表达的 3 种蛋白中有 2 个是高速泳动族蛋白 1；在 R15H20 细胞中表达量降低的 2 种蛋白是 maspin 的前体。

Wang 等[5]对非小细胞肺癌细胞进行核质蛋白 α2 亚基（KPNA2）基因敲除处理，用定量蛋白质组学分析发现 KPNA2 基因所调控的蛋白的功能包括细胞循环、DNA 代谢、细胞运动等。此实验表明了定量蛋白质组学的实用性，并为研究非小细胞肺癌中 KPNA2 的作用提供一个平台。

肺癌转移严重威胁着患者的生命，也是肺癌患者治疗 失败和死亡的主要原因。蒋代凤等[6]对肺巨细胞癌高、低转移株进行了蛋白质组学分析，鉴定与肺癌转移相关 11 个 蛋白，其中有两个蛋白尚未见报道，分别是蛋白核氯离子通道蛋白 1（CLI1）和白介素 18（IL-18），有可能成为新的肺癌标记物。高利伟等[7]采用 2-DE 方法分离人高、低转移大细胞肺癌细胞株的总蛋白，通过对 13 个差异明显的蛋 白质点研究发现，这些差异蛋白质多与肿瘤的侵袭转移相关，这为肺癌转移的病理机制和相关的分子标记物研究提供线索。

蛋白质组学也可选择差异蛋白为研究肺癌细胞耐药性提供新方法。况鹏等[8]运用蛋白质组学研究方法比较人肺癌细胞株 A549 和顺铂（DDP）耐药细胞株 A549/DDP 中的蛋白表达差异。结果显示，A549 和 A549/DDP 细胞中有 8 个蛋白质点的表达差异大于 5 倍，这些蛋白与细胞代谢、凋亡等有关。

为寻找新型肺癌生物标记物，Planque 等[9]针对非小细胞肺癌（腺癌，H23）、鳞状细胞癌（H520）、大细胞癌（H460）和小细胞肺癌（H1688）4 种组织学背景差异肺癌细胞株采用 LC-MS 技术进行蛋白质组学分析，成功地确定了内部控制蛋白质，即与激肽释放酶相关的肽酶 14 和 11，以及 IGFBP2。同时还发现了已知的肺癌肿瘤标记物，例如鳞状细胞癌抗原（SCCA）、癌胚抗原（CEA）、嗜铬粒蛋白A（CGA）、肌酸激酶脑型同工酶（CK-BB）、前胃液素释放肽（PRP）、神经细胞黏附分子（NCAM）与 Tu M2-PK。并通过关联癌症进行组织特异性化验、功能分类、文献检索等，初步确认 5 种新型的肺癌候选生物标记物：ADAM-17、骨保护蛋白、pentraxin 3、卵泡抑素（FS）和肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员 1A。另外，Zeng 等[10]应用 LCM 技术分离纯化的正常人支气管上皮细胞（NBE）、鳞状上皮化生（SM）、非典型增生（AH）、原位癌（CIS）、浸润性肺 鳞癌等组织，采用 LC-MS 分析技术和 iTRAQ 标记方法，首次表明了 3 种差异蛋白 GSTP1、HSPB1 和 CKB 可作为喉鳞状细胞癌（LSCC）早期诊断的新型潜在标记物。3 种蛋白的联合能对 NBE、癌前病变（SM、AH 和 CIS）和浸润性肺鳞癌这三者完美地加以区分，并通过永生化人支气管上皮细胞系 16HBE 得到 GSTP1，再测量其对易致癌物质苯并芘诱导 16HBE 细胞转化的敏感性，证明 GSTP1 向下调节将直接影响支气管上皮癌发生。由此可见，细胞培养蛋白质组学方法可用来鉴别不同种细胞差异蛋白，为选择潜在的早期肺癌标记物提供基础依据。

2 肺癌组织的蛋白质组学研究

在人类疾病蛋白质组学研究中，人体样本是最有价值、最直接和最具说服力的实验材料，样本收集是蛋白质组学重要的基础工作。

为筛选肺癌早期诊断及治疗的分子标记物，燕贞等[11]收集 22 例肺鳞癌组织及其 5 cm 外的正常组织，利用 2-DE 方法分离总蛋白，选择在癌组织中高表达的 10 个差异蛋白质点进行质谱分析，鉴定为膜联蛋白1（annexin-1，Anx-A1）、热休克蛋白 27 等与细胞周期、信号转导等功能相关的蛋白。

张慧珍等[12]收集 8 例肺癌组织及其癌旁组织，用 PDQuest 凝胶图像分析软件进行分析发现，有 12 个蛋白质只在肺癌组织中有表达，6 个蛋白质只在癌旁组织中有表达。钙粒蛋白 B 等肺癌特异表达的相关蛋白质点的鉴定有助于肺癌蛋白标记物、肺癌发生和预后的研究。

Alfonso 等[13]对 12 例肺癌及癌旁组织中提取组织蛋白，对比二维蛋白质谱图，发现不同类型和不同阶段的肺癌组织谱图大不相同。经过质谱鉴定，得到 21 种蛋白，这些蛋白与能量代谢、细胞骨架、抗氧化等有关。

Chen 等[14]用质谱鉴定法在 93 例肺腺癌和 10 例正常组织中对真核起始因子（eIF-5A）的表达进行鉴定，结果发现 eIF-5A 蛋白在肺癌患者组织中高表达，且 eIF-5A 蛋白的 mRNA 表达水平也明显高于正常人，这表明 eIF-5A 蛋白有可能作为肺癌早期诊断的肿瘤标记物。

Kikuchi 等[15]对鳞癌组织、腺癌组织和正常肺组织蛋白进行深入研究，在癌症组织中发现的 25 个差异蛋白中包括一些已知的癌症标记物，如：癌胚抗原、鳞状细胞癌抗原、神经元特异性烯醇化酶等。其中鳞癌组织特有蛋白如降钙素相关多肽 α、嗜铬粒蛋白 B 等和腺癌组织特有蛋白如类视锥蛋白 1、基质金属蛋白酶 10 可为癌症的治疗提供潜在的靶点。

Tan 等[16]对 12 个肺鳞癌组织及相应的正常组织进行 2-DE 和MALDI-TOF/TOF MS 分析，发现与正常组织相比肺癌组织有 28 个蛋白的表达发生了显著性的变化，表达 量上调的蛋白有异柠檬酸脱氢酶 1（IDH1）、超氧化物歧化酶 2、14-3-3ε 等，表达量下调的蛋白有过氧化物氧化还原酶 2 等。对非小细胞肺癌（NSCLC）患者血清蛋白进行研 究，发现在 NSCLC 患者中血清 IDH1 表达量增多，表明 IDH1 可作为 NSCLC 的血清和组织化学生物标记。

3 肺癌血清的蛋白质组学研究

血清蛋白质组学（serum proteomics）是蛋白质组学的一个重要分支，血清蛋白与组织、细胞蛋白相比，蛋白数量最多、蛋白含量差别大。血清样品易获得，且产生的创伤小，被广泛用于比较肿瘤和非肿瘤患者血清的蛋白质组学差异及肿瘤候选标记物的检测[17]。

沙慧芳等[18]采集健康者、肺部炎症患者和肺癌患者的血浆各 10 例，应用差异凝胶电泳、MALDL-TOF-MS 和生物信息学技术，对这些血浆进行蛋白质组学研究，筛选出其中 7 种血浆高表达的肿瘤相关蛋白，这些蛋白有可能作为肺癌标记物来检测肺癌。

聂赣娟等[19]采集 23 例肺癌患者和 14 例健康人的血清，以及 30 例肺鳞癌组织和 20 例癌旁组织，运用蛋白质组学比较研究，识别了 10 个差异蛋白质点，鉴定了 4 种差异蛋白。结果显示，在肺鳞癌血清中结合珠蛋白 2 的表达量高于健康人；HP-2 在肺鳞癌组织中的表达水平高于癌旁正常支气管上皮组织。这可以为通过检测血清蛋白诊断肺鳞癌提供参考价值。

Choi 等[20]利用 2-DE 和 MALDI-TOF-MS 检测高脂膳食调节对小鼠肺癌血清蛋白的影响，与正常组比较鉴定出 14 个差异蛋白，根据蛋白功能分为饮食相关类和肿瘤相关类两类。其中有 10 个蛋白与肥胖和癌症都有关系，另外 4 个只与癌症有关，这项研究可为治疗肥胖引起的癌症提供新的方法。

Rostila 等[21]对石棉导致的肺癌组织、石棉照射的正常组织、肺癌患者和吸烟的健康人的肺组织进行蛋白质组学研究，发现 peroxiredoxin 1 是一种新型的肺癌标记物。血清中高表达的原肌球蛋白与石棉辐射相关，PRX1 和 PRX2 的表达量和吸烟量成负相关，高表达的 PRX1 可能导致基因损伤，这项研究为肺癌和与石棉相关疾病的鉴定提供了新的生物标记物。

Chatterji 和 Borlak[22]发现，肺泡上皮细胞针对性的过度表达 c-myc 基因可导致肺癌。对荷瘤鼠进一步研究发现，血清类黏蛋白 8、α-2 巨球蛋白、载脂蛋白 A1（apoA1）、载脂蛋白 C3（apoC3）谷胱甘肽过氧化物酶 3、血浆视黄醇结合蛋白、甲状腺素运载蛋白的表达受癌症影响。在癌症晚期，载脂蛋白 E 的表达减少，并且血清淀粉样蛋白 p 成分只在癌症晚期表达。大多数疾病调节蛋白携带编码基因的启动子 E-box 序列（CACGTG），为其通过 c-myc 进行蛋白调控提供了相当重要证据。同时，α-2 巨球蛋白、甲状腺素运载蛋白、抗胰蛋白酶和裂解素在不同的肺肿瘤模型中均有表达，通过荷瘤鼠 c-myc 与 c-raf 的血清蛋白比较，血清类黏蛋白 8、载脂蛋白 A1、载脂蛋白 C3、载脂蛋白 E、谷胱甘肽过氧化物酶 3、血浆视黄醇结合蛋白、血清淀粉样 P 成分在两者中不同时表达。因此，这些蛋白可推荐为区分 不典型腺瘤样增生（AAH）和细支气管肺泡癌（BAC）或乳头状腺癌（PLAC）的候选生物标记物。

Ueda 等[23]利用所获得的肺癌患者和健康者血清，采用 SELDI-TOF-MS 技术和偶合凝集素蛋白质芯片阵列技术结合进行分析，鉴定出 41 个蛋白质峰值水平有显著性差异 （P ＜ 0.05），并确认癌症患者在载脂蛋白 C3 上Neu5Ac (α2,6)Gal/GalNAc 结构的缺损。结果还表明，偶合凝集素的蛋白质芯片技术允许高通量和特定癌变的糖蛋白的识别，暗示了该种蛋白质芯片适用其他疾病研究的可能性。

Zeng 等[24]选择一组非小细胞肺癌的病例血清（从 54 例患者中选择腺癌 9 例，鳞状细胞癌 6 例）和相应的对照组。对照组还包括从临床患者中选择的良性肿囊 8 例，健康人 8 例。首先用免疫亲和法去除最高丰度的血清蛋白，剩下的血清蛋白进行糖蛋白富集，随后进行 LC-MS 技术分析。结果发现，22 个差异蛋白中的 38 个高丰度表达的糖基化多肽在病例组和对照组显著性不同（P ＜ 0.01，t 检验）。在层次聚类上，这些高丰度表达的蛋白在病例组和正常组几乎完全分开。3 种候选的丰度差异蛋白经 ELISA 验证，和色谱结果具有很强的正相关性。

Diamandis 等[25]从 203 名肺癌患者（其中 180 例为重度吸烟的高风险诱发肺癌者）、43 例非肺癌的癌症患者中选取 422 例样本，鉴定了 pentraxin-3（PTX3）、激肽释放酶 11（KLK11）和颗粒蛋白前体蛋白（progranulin）3 个候选的肺癌生物标记物。结果发现，PTX3 是一种新的肺癌血清生物标记物，其诊断的敏感性和特异性等指标已达到其他类似的应用于临床的肺癌生物标记物水平。

4 问题和展望

肺癌的早期诊断一直是临床医学重要的研究课题之一，目前蛋白质组学已成为肺癌早期诊断的重要工具，但距离真正大规模应用于临床尚有很长一段路要走。存在的主要问题包括样品的制备、蛋白质的有效分离与鉴定、蛋白质数据库的进一步完善等。另外，肺癌标记物的发病机制研究只是刚刚起步，我们相信随着技术的发展，蛋白质组学研究有望在探索肺癌发病机制、肺癌早期诊断、寻找有效的肺癌治疗靶点和研发治疗肺癌药物等方面发挥重大作用，为人类最终战胜这一疾病作出贡献。

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