内皮祖细胞对心血管疾病的作用

张玉静(综述)，芶大明(审校)

(遵义医学院附属医院麻醉科，贵州遵义 563099)

内皮祖细胞是一群具有游走及增殖分化功能的幼稚细胞，主要来源于骨髓，对其定义主要为表达或共表达CD34/CD133/CD309表面抗原的一类干细胞，这类细胞在体外能增殖形成细胞集落，并逐渐分化为成熟内皮细胞。在心血管疾病病人体内，发现内皮祖细胞的数量减少，同时伴随其功能的降低。在临床应用他汀类药、ACEI、胰岛素等治疗能诱导内皮祖细胞的动员和释放，并通过VEGF/Akt/eNOS等通路参与病变血管的修复及改善病人的预后。

1 EPC的来源、鉴定及计数

1997年Asahara等首次从循环外周血中提取单个核细胞，用内皮专用的培养基培养，发现了能增殖分化形成内皮细胞集落的一种干细胞，考虑到其作为内皮细胞的前体细胞，命名为内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)［1］。随后 Murohara等在脐带血中发现了能在体外诱导下分化为成熟内皮细胞的一种干细胞，认为脐血中也存在EPCs［2］。EPCs主要来源于骨髓，此外亦有可能来源于脂肪组织/血管壁(尤其是外膜)/脾脏/肝脏及肠道［3］。

EPCs是一群具有游走及增殖分化功能的幼稚细胞，在分化过程中会表达某些表面分子，利用流式细胞技术对特定的标记物分析能从外周血/脐血以及骨髓中检测到并计数EPCs。EPCs最基本的特点是具有增殖能力，在体外用特定的培养基(EGM－2/M199)，一周左右能增殖分化形成细胞集落，形态多呈铺路石样，中间细胞较密集，周围细胞呈放射状分布，此类细胞能摄取DiL(1，1＇－dioctadecyl－ 3，3，3＇，3＇－ tetramethylindocarbocyanine perchlorate)标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)，并且其细胞膜表达的某些分子能和荆豆凝集素1(Ulex europaeus agglutinin－1 lectin，UEA －1)结合［4］。对EPCs的鉴定，常用的表面分子抗原的组合是CD34+、血管内皮生长因子受体－2(CD309+)和CD133+分子，任何一种单独的表面分子对EPCs来说都没有特异性，并且EPCs在分化的过程中，逐渐弱表达或不表达CD133+这个表面分子，丢失CD133这个表面分子意味着向更成熟的内皮样细胞分化，此过程可能主要发生在EPCs从骨髓迁移到外周血的早期，成熟的内皮细胞不表达CD133分子［5］。因此，同时表达 CD133/CD34/CD309的细胞称为早期EPCs，晚期的EPCs弱表达或不表达CD133且逐渐表达内皮细胞的标记如:CD31和von Willebrand factor等。

对EPCs的计数缺乏标准的方法，流式细胞技术能同时对多种表面标记进行分析，但通过流式细胞技术定义EPCs比较抽象，只是某一种或多种抗原组合阳性的细胞类型［4］。EPCs主要存在于骨髓，外周血的含量极少，利用EPCs的增殖能力这一特性，通过体外培养扩增的方法，对其有增殖能力的细胞进行内皮系方面的相关检测，染DiL－ac－LDL(带DiL荧光的acLDL)和FITC－UEA1(带FITC荧光的 UEA1，FITC－ fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)，计数其集落数［4－5］，此方法缺点亦较明显，体外条件与体内的不一致将导致一定程度的失真，且计数亦有较大的不准确性［4］。两种方法各有优缺点，多结合两种方法，用流式细胞技术计数体内EPCs含量，而体外扩增则有鉴定的作用，能验证EPCs的增殖、分化及迁移能力［6］。

2 EPC的动员及血管内皮修复作用

骨髓有“干细胞库”之称，EPCs的动员主要依赖局部的微环境改变。各种动员因子抑制干细胞和间质细胞的转化，最后干细胞通过跨内皮迁移离开骨髓到外周血中，间质细胞上有能与造血干细胞结合素类结合的位点，许多蛋白酶类的激活能裂解此类结合位点，从而抑制这种转化，如弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、基质金属蛋白酶。缺血被看作是引起EPCs由骨髓向外周血动员的主要信号，缺血通过上调VEGF(血管内皮生长因子)、SDF－1(基质细胞衍生因子1)等因子水平，通过依赖基质金属蛋白酶－9的机制而动员 EPCs［6］。影响 EPCs数量和功能的因素有很多，VEGF、SDF－1、集落刺激因子(GM －CSF、G －CSF、EPO)、他汀类药、PPARγ激动剂(罗格列酮)、雌激素和体育训练等均能一定程度诱导和加强EPCs的动员［6－7］。神经生长因子(NGF)能促进CD34阳性细胞增殖，能增加CXCR－4(一种EPCs迁移和归巢的重要细胞因子受体)在CD34+阳性细胞的表达，且导致其向SDF－1迁移能力增强，还能增加其血管样结构形成的能力［8］。有学者发现巨噬细胞迁移抑制因子在EPCs动员中起重要作用，且能在体外促进 EPCs趋化［9］。

过去，对受损的血管内皮的修复及再生，总认为其机制是通过邻近的血管内皮细胞的增殖和迁移来完成。随着研究的深入，此修复过程有其他机制参与。其一，循环EPCs能归巢于球囊造成的动脉内皮剥脱的部位，促进动脉内皮的再内皮化，这可能与内皮抗增殖介质如NO的合成有关;其二，在狗身上可以看到，移植到其体内的涤沦移植片表面迅速被表达CD34标记的造血干细胞覆盖，同时在人的很多血管辅助装置表面，都能被共表达CD133和VEGFR－2的干细胞覆盖;其三，利用骨髓移植试验也发现骨髓来源的细胞对移植物和裸露的血管的再内皮化有作用［6］。这些研究表明，血管内皮损伤后的再内皮化与内皮祖细胞有很大的关系。

体外实验表明:EPCs能在体外扩增并分化为内皮细胞［1，5］，并能形成血管样结构［1，10－11］。将外周血单个核细胞来源的体外扩增的EPCs注入后肢缺血动物，能明显改善缺血状况及增加新生血管的形成［12－14］。以上研究表明，EPCs能分化为内皮细胞参与内皮的修复，并能参与出生后的新生血管形成，与血管病变如心血管疾病、风湿血管改变、糖尿病血管并发症等有密切联系。

3 EPC与心血管疾病

心血管疾病多表现为血管功能的失衡，主要以血管内皮的损伤及修复失衡作为其发病的病理生理机制，而EPCs作为血管内皮细胞的前体细胞，使得大量的学者想到其可能参与损伤内皮的修复。

心血管危险因素能预测心血管事件发生的可能性大小。Hill的研究表明，心血管危险因素和EPCs的数量和功能之间有密切的联系。心血管危险因素越高，则病人外周血 EPCs含量就越少。Mariuca通过对冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)和正常人研究发现:有CAD的病人组EPCs数量较正常人组明显减少，其迁移能力降低［15］，且心血管危险因素和 EPCs水平成负相关［16］。Caroline等对伴有CAD的病人进行分析，发生心血管事件(心血管死亡、不稳定心绞痛、心梗、经皮冠状动脉血管腔内成形术、冠状动脉搭桥或缺血性中风)的病人有着较低水平的EPCs，即EPCs数量的减少预示着将会导致较高的心血管事件的发生率［17］。EPCs在维持血管内皮完整性和稳态方面有重要作用，在心血管功能失衡的病人体内，机体从骨髓里动员EPCs释放到外周血后，起到修复失衡血管内皮及减缓心血管病变发展进程的作用，因此EPCs水平能独立预测心血事件的发生及发展［17－18］。

在退行性变主动脉瓣狭窄病人中，EPCs的数量和功能相比正常人都不同程度受损，提示了EPCs数量和功能的改变可能参与瓣膜退行性变的进程［19］。先天性主动脉瓣二叶式畸形(BAV)病人中，EPCs亦可能参与主动脉瓣膜的修复，延缓主动脉瓣变性的进程，于是在BAV病人中，发现有中度瓣膜狭窄/返流者比无狭窄/返流者外周血EPCs水平低，且迁移能力下降［20］。

急性心梗病人早期亦有EPCs的动员以参与阻塞血管的修复和再通［21］，心梗后7d左右，EPCs的动员达高峰。Thomas等利用鼠急性心梗模型，发现心梗后早期(7d前)可能由于骨髓内活性氧簇的增加以及金属蛋白酶9受损，减少了EPCs的动员［22］。利用心梗动物模型，与对照组相比，注射体外扩增的EPCs后，能增高心肌梗塞区血管密度及梗死心肌瘢痕边缘毛细血管密度，缩小梗塞心肌面积，能提高左室射血分数明显改善心脏血供和心功能，并且降低左室疤痕形成［22－23］。有学者尝试将体外扩增的EPCs用于心梗病人，能明显改善冠状动脉血流储备和左室功能［25］。赵子粼等对38例心梗后心衰的患者，利用皮下注射G－CSF(粒细胞集落刺激因子)600 ug/d连续7d来动员内皮祖细胞，发现可有效改善心功能，减轻心室重构，降低心肌能量消耗［26］。

合并微量白蛋白尿的高血压病人有内皮细胞凋亡的增加和循环EPCs水平的降低［27］，高血压引起EPCs损伤的机制可能与肾素－血管紧张素－醛固酮系统活性增高有关，可能因为血管紧张素2降低EPCs端粒酶活性，并通过增加氧化应激加速EPCs衰老，同时醛固酮可以减少血管内皮生长因子受体2的表达以及抑制信号转导通路活性，从而抑制骨髓EPCs的分化。

此外，Gerhard－paul等报道在特发性肺动脉高压病人外周血内循环EPCs数目明显较正常人减少［28］。内皮功能障碍在肺动脉高压(PAH)的发病机制中起重要作用，在伴有PAH的镰刀型红细胞贫血病人中EPCs及其亚型明显较不伴PAH的病人低，较低的EPCs可能与肺血管的病理改变有关［29］。

4 EPC与临床应用

想成功利用EPCs为临床服务是一个复杂的多步骤的过程，其包括EPCs的动员、归巢到特定的部位、粘附、进一步的分化以及功能的整合［30］。同时EPCs具体修复血管的具体机制仍未完全被了解，没有一个统一的可以令大家都信服的机制。且在某些因素影响下，EPCs可能对疾病没有治疗作用，反而起到消极作用。

他汀类药和血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)是临床心血管病人常用的药物，研究发现他汀类药能通过增强内皮型一氧化氮的生物利用率而增加了EPCs的动员，从而增加心肌新生血管形成、改善了左室收缩功能、抑制了心肌纤维化以及提高了心梗后的存活率［31］。他汀类还可以通过 PI3K/Akt通路而增强EPCs增殖及分化［32］。ACEI(血管紧张素转化酶抑制剂)类药(雷米普利)治疗能增加CAD病人的外周血EPCs数量以及增强EPCs修复缺血损伤的功能［14］。他汀类药和ACEI可能通过不同的药物作用机制影响骨髓内的某些分子表达水平而增加了EPCs的动员［22］。

心血管病变是糖尿病的主要并发症之一，有研究发现胰岛素具有重要的心血管保护作用，能促进EPCs从骨髓动员到外周血，增加了后肢缺血鼠模型的毛细血管密度;胰岛素治疗也恢复了缺血诱导SDF－1α 和VEGF的释放，加强Akt、eNOS(内皮型NO合酶)和骨髓内MMPE－9的活性;表明胰岛素治疗能通过VEGF/Akt/eNOS相关通路引起的EPCs的动员从而增加糖尿病鼠新生血管的形成改善缺血［33］。

任何事物都有两面性，EPCs在产生有利作用的同时在某些方面仍会起到消极的作用，Pelliccia等对155例连续被诊断为心绞痛的患者，在行选择性经皮冠状动脉支架置入前取外周血行流式细胞仪测定EPCs含量，8个月后行血管造影发现再狭窄的患者比健康对照组及其它没有狭窄的患者组都具有更多的内皮祖细胞及其亚群［34］。EPCs可能参与血管内膜的增生，引起再狭窄。

5 展望

EPCs在血管疾病变方面有较大的治疗前景，对心血管疾病、糖尿病以及其它以血管病变为基础的疾病均有一定的预测和治疗作用。心血管疾病目前治疗手段费用昂贵以及效果并不十分完美，所以EPCs的发现可能会为未来预防和治疗此类疾病产生深远影响。想要成功利用EPCs为临床服务，还需解决多种问题:①加强对EPCs的基础理论知识方面的研究，目前对EPCs并未发现其唯一的表面分子，各学者所用的表面抗原组合各有不同，且各表面分子缺乏一定的特异性，另外对其动员、释放、归巢、血管形成的确切机制并不十分清楚;②加大动物实验的研究，以期解决好体外扩增EPCs回输体内后的安全性及EPCs体外培养的纯度等问题;③增加大样本的临床病例研究，目前临床应用方面多只是观察到EPCs数量和功能的改变与CAD有关系，用体外扩增EPCs再回输体内的方法仍有一定的技术问题需要解决，用某些诱导剂刺激EPCs动员也其动员效果比较有限且有一定的其它方面的影响。随着研究的深入，以期将来能准确掌握EPC的作用机制，更好更安全的为临床服务。

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