衔接分子胱天蛋白酶募集域蛋白9与抗结核免疫的相关性

孙蕾 郑锦辉 王毳 费思平 赵卓

结核病是一种慢性传染病，全球每年约有170万例患者死于结核感染［1］。我国结核病患者例数居世界第二位，也是耐药结核病流行严重的国家之一，因结核病死亡的人数超过其他传染病死亡人数的总和。因此，研制有效的抗结核药物和新型疫苗迫在眉睫。这需要对宿主与Mtb相互作用机制、抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）内部信号传导机制及其关键分子进行深入理解。

Mtb进入人体后，Mtb表面病原体相关分子模式（pathogen－associated molecular patterns，PAMPs）被模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别［2］，巨噬细胞、树突状细胞和上皮细胞均表达PRRs［3］。PRRs与PAMPs结合后，PRRs将信号传递给衔接分子，后者启动下游的信号级联反应，诱导固有免疫细胞合成细胞因子，活化宿主免疫。一个衔接蛋白可接受多种受体的信号，因此，衔接蛋白在宿主免疫中起着关键作用。胱天蛋白酶募集域蛋白 9（caspase recruitment domain－containing protein 9，CARD9）能识别多种Mtb受体［4］，在抗结核免疫中发挥着重要作用。以下仅对CARD9及其在抗结核免疫中的作用机制进行简要阐述。

CARD9的结构与分布

CARD9属于CARD蛋白家族，位于染色体9q34．3，cDNA全长2108bp，编码536个氨基酸残基，合成相对分子质量为62 300的蛋白质。CARD9有2个功能区，一个位于CARD9的N末端，为胱天蛋白酶募集域，有7～98个氨基酸残基。另一个位于C末端，由7肽重要特征的卷曲螺旋域组成，至少有3个氨基酸残基段，分别为140～230、243～277、332～419的卷曲螺旋域，这个区域对于蛋白的寡聚化功能具有重要作用［5］。CARD9在多种组织中表达，包括肺、肝、脾、子宫、外周血和骨髓。CARD9在骨髓源细胞中表达，如树突状细胞（dendritic cell，DC）和骨髓源巨噬细胞（bone marrow－derived macrophages，BMDMs）等，而在淋巴结和T、B细胞中不表达［3］。

CARD9在抗结核免疫中的作用

一、CARD9是传递多种识别Mtb相关受体信号的中心分子

Mtb细胞壁表面包含大量结构不同的分子，分别由不同的PRRs识别。含有免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine－based activation motif，ITAM）的受体与相应配体作用后，活化衔接分子CARD9，CARD9与Bcl10／Malt1信号作用模块结合，形成三分子复合体，将信号传导给转录因子NF－κB途径［6］。衔接分子CARD9与多个信号途径有关，是多种识别Mtb受体下游的中心衔接分子。CARD9选择性接受来自BMDMs的dectin－1受体、NOD2（nucleotidebinding oligomerization domain－containing protein 2）类受体和巨噬细胞诱导性C型凝集素样受体（MINCLE）的信号，与脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）和（或）CARD9相关的受体对控制Mtb的固有免疫至关重要［7］。上述受体分别与抗结核的前炎症反应、诱导少量肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）释放和诱导少量细胞活化有关。

二、CARD9是控制结核固有免疫的重要分子

作为传递多种识别 Mtb受体信号的中心分子［8］，CARD9是控制结核病必不可少的。Mtb的大量繁殖和过度的炎症导致感染结核CARD9敲除（CARD9－／－）鼠的死亡，同时，依赖CARD9的中性粒细胞又是控制结核固有免疫所必须。强调了固有免疫在结核保护和病理中的双重作用。细菌繁殖和炎症控制对疾病的预后有决定性作用［4］。

（一）CARD9缺陷导致Mtb感染鼠严重的炎症反应

在感染Mtb前3周，CARD9－／－鼠体内出现更高的菌浓度，肺部浸润大量中性粒细胞，肺实质细胞死亡率增加，肺实质死亡细胞清除减弱，肉芽肿形成减少，致死性病理过程伴随以加速的炎细胞积累为特征的严重炎症反应［4］。

1．Mtb感染CARD9－／－鼠肺部大量中性粒细胞浸润的机制：Mtb感染CARD9－／－鼠的肺部损伤以中性粒细胞炎症和继发性坏死的细胞凋亡为特征，这些病理特征与局部合成粒细胞集落刺激因子（G－CSF）、角化上皮来源的化学因子（keratinocyte－derived chemokine，KC）、单核细胞趋化蛋白－1（MCP－1）和系统释放G－CSF有关。这些细胞因子由BMDMs、内皮细胞和上皮细胞合成，进而刺激粒细胞合成，并招募粒细胞到感染组织部位。

在感染期间，KC的合成增强，不成熟粒细胞被释放到外周。G－CSF刺激中性粒细胞分化成熟和功能活化。G－CSF和KC刺激、趋化骨髓来源的粒细胞移动到感染部位。CARD9－／－鼠体内，促进中性粒细胞分化和招募的MCP－1和细胞因子升高，诱导粒细胞到达外周，KC加速招募粒细胞到肺部。因此，在感染组织部位能检测到多形核中性粒细胞（polymorphonuclear，PMN）转录，CARD9－／－鼠血清中粒细胞来源的髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）浓度增加。

CARD9是Mtb感染的PMN合成白细胞介素－10（interleukin－10，IL－10）必不可少的［4］。CARD9－／－鼠IL－10缺 失使其对各种细胞因子和化学因子的负反馈丧失，IL－10负反馈调节的缺乏导致粒细胞炎症的恶性循环和无效的凋亡细胞清除，增加了炎症反应。

2．大量中性粒细胞浸润是导致Mtb感染CARD9－／－鼠死亡的关键因素：为了解中性粒细胞浸润对CARD9－／－鼠生存的影响，采用两种治疗方法并进行评估。第一种治疗方法用洛伐他汀治疗 Mtb感染CARD9－／－鼠，加速除去肺部的凋亡细胞，缓解凋亡细胞引起的继发坏死，减轻组织损伤。第二种治疗方法用抗体中和G－CSF，调节炎症反应。对两种治疗方法进行评估，前者不能改善CARD9－／－鼠生存，而后者能有效延长Mtb感染CARD9－／－鼠的生存时间，改善肺部炎症，减少肺部炎细胞，降低血液中粒细胞水平和MPO浓度。因此，限制炎症和肺部粒细胞浸润是延长Mtb感染CARD9－／－鼠生存时间的关键。中性粒细胞在肺部积累的程度与疾病的严重程度平行，也证实中性粒细胞在疾病的致死性结果中起关键作用［4］。

在结核感染急性期，清除PMN或中和G－CSF有利于改善CARD9缺陷条件下粒细胞的病理功能。CARD9－／－鼠中，抗Gr－1抗体（淋巴细胞抗原6G抗体）的治疗能影响Gr－1＋的单核细胞，延长CARD9－／－鼠的存活时间。尽管除去PMN和减轻炎症能延长CARD9－／－鼠存活时间，但不能明显影响肺部的细菌量，表明炎症能够单独导致CARD9－／－鼠死亡。CARD9－／－鼠的巨噬细胞感染Mtb后，合成的一氧化氮（nitric oxide，NO）量 与 对 照 细 胞相同。在 体 内，CARD9－／－鼠感染Mtb后，表达抗菌效应分子的能力未被削弱，表明抗菌效应分子不是导致CARD9－／－鼠对 Mtb敏感度增加的原因。

3．大量中性粒细胞浸润导致Mtb感染CARD9－／－鼠死亡的原因：Mtb感染的CARD9－／－鼠中，继发坏死导致的间接损伤和MPO的系统释放是影响小鼠生存的关键因素。中性粒细胞释放坏死渗透酶和毒性因子，这些物质损伤外周组织，而对Mtb没有作用。粒细胞释放的MPO对肺泡巨噬细胞具有细胞毒性，活动性肺结核患者血中MPO水平增加［9］。

（二）CARD9缺陷影响Mtb感染的APC分泌细胞因子的能力

Mtb感染中，CARD9对巨噬细胞分泌细胞因子起到至关重要的作用。用 Mtb感染 CARD9－／－的 BMDMs和DCs，这两种细胞将病原体内在化的能力和消除凋亡细胞的能力与对照细胞相比没有削弱，但CARD9－／－的BMDMs合成前炎症细胞因子TNF、白细胞介素－6（IL－6）和血清趋化因子5（CCL5）能力减弱，合成白细胞介素－12（IL－12）减少，释放白细胞介素－1β（IL－1β）缺陷［4］。CARD9能通过IL－1β的释放环节影响其释放，从而调节炎症。低水平IL－1β诱导迟发中性粒细胞反应［10］。TNF合成减少与肉芽肿形成减少有关［11］。CARD9缺陷减少转录因子 NK－κB的核移位［12］，趋化因子CXCL2（MIP－2）的启动子含有 NF－κB的结合部位［13］，使得 MIP－2合成下调。IL－6合成的减少能直接减少趋化因子CXCL1（KC）的合成。

（三）CARD9缺陷影响宿主固有免疫，而非获得性免疫

检测Mtb感染CARD9－／－鼠肺部T细胞亚群、CD4＋T细胞和CD8＋T细胞的比例，以及T细胞功能，CARD9－／－鼠与对照鼠差异无统计学意义。两者对Mtb产生相同程度的迟发型超敏反应，并且卡介苗诱发的保护性免疫相同，T淋巴细胞合成的细胞因子量一致。因此，获得性免疫不受CARD9缺陷影响［4］。

CARD9的缺陷不影响T细胞对 Mtb的反应。CARD9－／－鼠在感染Mtb后，体内Th1反应正常。细菌表面布满各种PAMPs，这些分子模式同时激活多种PRRs，Mtb被多种受体识别并不受单一受体配体反应的限制。因此，尽管Syk－CARD9途径参与合成IL－17的CD4＋T细胞的分化，Th17对Mtb的应答没有任何缺陷。结核亚单位疫苗佐剂核心因子正6，6－二霉菌酸海藻糖（索因子）［trehalose－6，6′－dimycolate（cord－factor），TDM］和其合成类似物6，6－二十二酸酯海藻糖（trehalose－6，6′－dibehenate，TDB）依赖 于 MINCLE 和Syk－CARD9信号途径活化巨噬细胞，通过固有免疫发挥佐剂活性［14－15］。尽管获得性免疫未受到影响，CARD9－／－鼠仍然存在严重的固有免疫缺陷。CARD9缺陷的条件下，炎症得不到控制。

结论与展望

Mtb或疫苗进入人体，与APC相互作用，产生细胞因子，诱导人体产生免疫应答。免疫应答的强度与患者的预后密切相关，产生免疫应答的相关分子机制倍受关注。固有免疫细胞活化及其细胞因子的分泌是决定机体免疫应答重要而关键的环节。对APC的信号传导机制及其关键信号分子的研究具有重要意义。

作为多种受体的中心分子，CARD9在调节宿主抗结核感染的固有免疫中发挥重要作用。在体外，衔接分子CARD9缺陷削弱Mtb感染APC合成、分泌细胞因子的能力。在体内，CARD9－／－鼠出现以大量中性粒细胞浸润和肺部过度炎症为特征的病理表现。Dectin－1、NOD和 Mincle等受体均可通过衔接分子CARD9传递信号，这增加了宿主的脆弱性。探讨Mtb感染后宿主免疫细胞的信号传导机制及其关键分子的作用机制和CARD9多态性与宿主对Mtb易感性间的关系有助于深入理解结核病患者的发病、病程和预后，为患者制定个性化的治疗方案。

目前，临床主要进行Mtb及其耐药性的检测工作，缺少患者机体免疫对病程和预后影响的相关指标。通过对CARD9在抗结核免疫中作用机制的探讨，可以找到影响患者预后的免疫指标，并采取相应治疗措施，改善患者预后，延长患者生命。此外，CARD9在结核亚单位疫苗佐剂发挥活性中起到重要作用，对CARD9的研究可为开发结核疫苗奠定相关的基础。

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