内皮祖细胞与沉默信息调节因子2相关酶1在心血管疾病中作用的研究进展

桑甜甜 刘芳

冠心病在中国老年人中的发病率和死亡率迅速上升，其关键因素之一就是以血管内皮受损为基础的病理生理改变，内皮功能失调可导致血管收缩、血栓形成以及动脉粥样硬化。近年来，内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)移植促血管新生疗法作为一种重要的冠心病治疗手段开始应用于临床试验，并取得了一定的效果。

血液循环中低水平或受损的EPCs功能可增加冠状动脉疾病的发病危险，改善冠心病患者EPCs功能以增强其促血管新生作用已成为临床上亟待解决的问题。调控细胞衰老的沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulator 2 homolog 1，SIRT1/sirtuin 1)参与了EPCs的损伤和衰老过程，在心血管疾病中发挥着积极的作用。现就EPCs的研究进展及其与SIRT1基因在心血管疾病中的作用作简要综述。

1 EPCs概述

1.1 EPCs的来源

EPCs是由 Asahara等［1］首次从人类外周血中作为CD34+单个核细胞分离出来的未成熟前体细胞。它主要来源于人脐静脉血［2］、外周血［3］、骨髓。外周血中 EPCs数量占血细胞总数的0.0001% ～0.0500%，其比例差异源于抗体亲和力及个体健康状况的差异。机体出生后，EPCs大部分定居于骨髓，在某些生理、病理状态下，由骨髓释放入外周血分化为功能成熟的内皮细胞。

1.2 EPCs的鉴定方法

EPCs和造血干细胞有共有抗原，不同时期EPCs表面标志也随之变化。因此，EPCs的鉴定需要通过表面抗原与流式细胞术相结合或者集落形成实验来鉴定。经流式细胞术来鉴定EPCs的精确标准尚有争议，但如果结合了CD133、CD34等表面抗原表达方法，便可作为鉴定EPCs的严格标准。CD144等个别抗原表达也已经被使用，但对EPCs特异度较差［4］。EPCs可特异地摄取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)和荆豆凝集素1(UEA-1)［5］，实验室通常采用双荧光染色鉴定EPCs，但仍须结合其他相关检测方可确定EPCs。

1.3 EPCs在心血管方面的生物学功能

活性氧(ROS)和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)等在终末期慢性心力衰竭患者体内具有较高的浓度，可阻碍EPCs的释放，导致内皮细胞炎症反应，直接引起内皮损伤。这种血管损伤也导致了冠心病患者外周血循环中或骨髓中功能性EPCs的耗竭和损伤，尤其老年患者往往有EPCs的数量减少和功能障碍。因此，循环中EPCs的数量与血管内皮功能相关，与某些心血管疾病危险因素呈负相关，可作为血管功能的替代指标。Wassmann等［6］静脉注射EPCs和单核细胞治疗大鼠内皮功能障碍，1周后发现内皮依赖性血管舒张功能明显改善;45 d后受损内皮功能明显改善。

EPCs可从骨髓动员入外周血，能迁移至组织缺血或内皮损伤部位，替代病变内皮细胞，分化为功能成熟的内皮细胞，参与血管新生和维持内皮细胞完整性［7］。因此，增加循环中EPCs数量，增强其增殖、迁移、分化的能力可使EPCs更好地发挥促血管新生疗法的治疗作用。Chen等［8］发现慢性心肌缺血的小型猪冠状动脉移植的转基因EPCs迁移、存活和血管生成能力明显增强，表明转基因移植在治疗缺血性疾病上的潜能。

2 SIRT1概述

沉默信息调节因子2(silent information regulator 2，Sir2)最初发现于酵母中，其表达随酵母衰老而降低，高表达能不同程度地延长酵母寿命。SIRT1广泛分布于各种物种，均有高度保守型，统称为Sirtuins家族［9］。哺乳动物Sirtuin家族有7个同源基因，其中SIRT1与Sir2同源性最高，对其结构功能研究最为深入。

2.1 SIRT1的结构

SIRT1是一种进化上保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依赖的Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶。SIRT1蛋白质由两个结构域组成:大的保守性较高，主要由Rossmann折叠构成;小的结构域保守性较低，由锌带结构和一个螺旋构件组成。底物结合在大、小结构域之间的裂隙发生催化反应。SIRT1依赖NAD+发挥去乙酰化和自身激活的作用，蛋白底物每脱去一个乙酰基就会消耗一个NAD+，产生尼克酰胺［10］。

2.2 SIRT1的分布与核浆穿梭

SIRT1几乎在所有器官都有表达，而不同组织细胞、不同生长阶段的亚细胞定位各有不同。SIRT1起初被认为是一种核蛋白，而近来研究显示它在某些组织中定位于细胞浆，还有一些在浆核内均有表达，有核浆之间的穿梭运动。SIRT1在心肌细胞胚胎期主要定位于细胞核内，而在成熟啮齿类动物心肌细胞内主要在细胞浆内表达［11］。SIRT1在线粒体中也已经被检测到［12］。病理状态下，SIRT1穿梭于核浆之间，以调节一些细胞信号和应激损伤造成的结果。SIRT1的两个核内定位信号和两个核内输出信号是核浆定位的调节子，SIRT1的转运依靠一种介导蛋白质核浆穿梭的重要转运体蛋白——CRM-1蛋白，Tanno等［13］发现应用CRM-1抑制剂雷帕霉素B(LMB)可以抑制核浆穿梭。

SIRT1在细胞核内主要起到抗凋亡作用。Shinmura等［14］证实SIRT1对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用与一氧化氮依赖性的核内SIRT1增加有关。而SIRT1胞浆定位增加了细胞对凋亡信号的敏感度［15］。核内SIRT1转出至胞浆或许可促进核内靶蛋白的乙酰化，同时发生活性的变化。但是SIRT1去乙酰化酶活性在胞浆内可能也是有效的，因为已知的SIRT1作用底物包括p53和NF-κB等也穿梭于核浆之间发挥生物学作用。

3 SIRT1对EPCs的保护作用

SIRT1除了使组蛋白去乙酰化，与心血管系统相关的SIRT1底物还包括 p53、叉头转录因子(forkheadbox o，FoxO)、核转录因子(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR-γ)等。SIRT1通过影响基因转录和对下游靶基因去乙酰化来使EPCs抵抗氧化应激、抑制炎症、调控能量代谢、延缓衰老等，影响细胞增殖和生长。

3.1 抗氧化应激、抑制炎症

氧化应激与心血管系统疾病密切相关，SIRT1可抑制血糖过多引起的血管内皮细胞衰老，这种作用部分是通过减少氧化应激实现的，其过程与多种因子相关。高浓度葡萄糖引起了EPCs中活性氧的增多，损害烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)的功能，其本身可降低SIRT1水平，SIRT1下调引起了p53高表达和氨基末端激酶的活性，从而活化了单核细胞引起炎症［16］。高糖处理EPCs 3 d发现吞噬DiLDL/凝集素染色阳性的EPCs降低，伴有SIRT1表达减少、酶活性降低和乙酰化 FoxO1升高［17］。Balestrieri等［18］发现 2 型糖尿病患者与对照组相比EPCs细胞内SIRT1蛋白水平降低，同时上调了血小板活化因子(PAF)，表明高糖血症对糖尿病和外周血管并发症患者中EPCs功能特性造成的影响可通过PAF和SIRT1途径产生。

3.2 延缓衰老

SIRT1通过对其靶蛋白去乙酰化来延缓机体衰老。人衰老EPCs中eNOS降低，伴随一氧化氮的减少。SIRT1使eNOS上496和506位点赖氨酸残基去乙酰化，增加eNOS活性，促进内皮NO产生，抵抗动脉粥样硬化形成，延缓衰老。亚甲基四氢叶酸还原酶缺乏损害EPCs的形成，增加EPCs衰老，这种作用与eNOS和SIRT1解耦联以及SIRT1水平的下降有关［19］。Ferrara等［20］发现衰老使大鼠心脏内SIRT1活性明显降低，同时锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和过氧化氢酶表达也降低，而体育锻炼能显著增加SIRT1的活性，此变化抵消了年龄引起的各个系统的损害。另外，MicroRNA-34a对EPC的血管抑制作用是通过衰老和抑制SIRT1-FoxO1信号通路介导的;老龄小鼠EPCs血管新生功能减弱与MicroRNA-34a水平升高及其靶蛋白SIRT1的表达下降相关［21］。

3.3 促进增殖分化、减轻凋亡

SIRT1可通过某些物理作用和抗氧化应激来促进EPCs分化和减轻凋亡。血液流动引起的剪切应力明显活化了EPCs中Akt的磷酸化，促进了SIRT1的表达以及乙酰化组蛋白H3的下降并促进EPCs的分化［22］。氧化应激发生时，SIRT1能去乙酰化FoxO3并与其结合抵抗氧化应激。而SIRT1对FoxO3功能有双向作用:SIRT1能促进FoxO3诱导细胞周期阻滞和抵抗氧化应激的能力，也损伤了FoxO3诱导细胞凋亡的能力［23-24］。SIRT1增加了FoxO的抗氧化应激靶蛋白(如MnSOD)的表达，同时也削弱了FoxO的促凋亡靶蛋白(如Bim)的表达。反之，FoxO以正向反馈机制调节SIRT1的表达。在营养紧急缺乏的情况下，FoxO3a可通过占据SIRT1启动子内的两个p53结合位点来诱导SIRT1转录［25］。

4 SIRT1激活剂在心血管疾病方面的治疗潜能

SIRT1能促进EPCs增殖分化，帮助EPCs修复损伤的内皮细胞，而SIRT1激活剂可使SIRT1表达增加、活性增强，更好地促进血管新生，增强EPCs移植促血管新生疗法的治疗效果。因此，SIRT1激活剂在心血管疾病方面是一种有前景的治疗途径。白藜芦醇(Resveratrol)是一种植物抗毒素的多酚类抗氧化剂，存在于葡萄表皮、红酒等中，从2003年Howitz等［26］发现它能激活体外sirtuin和延长酵母菌自我复制寿命之后便成为了研究热点。

白藜芦醇可模拟外源性SIRT1过表达效应。在人冠状动脉内皮细胞中，白藜芦醇降低了稳态时线粒体ROS的产生，上调了MnSOD表达和细胞内谷胱甘肽水平;对冠状动脉内皮细胞编码质粒转染全长SIRT1可模仿白藜芦醇的抗氧化作用［27］;白藜芦醇可逆转人脐静脉内皮细胞H2O2导致的SIRT1 mRNA水平的降低，并诱导人脐静脉内皮细胞内源性SIRT1的表达［28］。它还可直接促进SIRT1去乙酰化酶的活性，然而这种作用仅于体外试验中荧光团与SIRT1底物共轭时发现。荧光团一旦移除SIRT1底物，体外试验中白藜芦醇对SIRT1去乙酰化酶活性的促进作用便检测不到［29］。目前对白藜芦醇直接在细胞内增强SIRT1去乙酰化酶活性的说法仍无定论。

随着研究不断深入，一些小分子激活物逐渐被发现，它们对SIRT1的活化效率比白藜芦醇高出1000倍，并对易患代谢性疾病的实验动物具有代谢功能上的益处［30］。一些复合物已经运用到了第二阶段临床试验，新的复合物也一直在被鉴定和开发。SIRT1的激活对整个个体的健康和年龄相关疾病的影响在一定程度上是有益的，以这种朝着SIRT1激活剂方向发展的稳定步伐，研制出对SIRT1高特异度和高生物利用率的治疗心血管疾病的新型药物近在咫尺。

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