Hedgehog信号通路与胰腺癌

马丹 高军 李兆申

Hedgehog信号通路与胰腺癌

马丹 高军 李兆申

胰腺癌是人类最难治愈的致死性恶性疾病之一，5年生存率不到5%，在美国，胰腺癌居癌症相关死亡的第四位。造成临床预后较差的部分原因是胰腺癌发生、发展过程中的机制尚未完全清楚。Hedgehog(Hh)信号通路是胚胎发育的主要调控子,其产物控制细胞分化、组织成形和细胞增殖。在成人正常组织中Hh信号通路已无表达或低表达。近年来，研究发现在胰腺癌中Hh信号通路异常是普遍存在的，100%胰腺癌存在Hh信号通路相关分子的基因突变[1]。本文就Hh信号通路的异常激活与胰腺癌的关系做一综述。

一、 Hh信号通路

Hh信号通路由配体Hh、膜受体Ptch及Smo、核转录因子Gli和下游靶基因组成。HH基因于1980年由Nusslein-Vollhard和Wieschaus在研究果蝇的基因突变时发现，该基因突变可以导致果蝇幼虫发育成刺猬一样的形态，故名Hedgehog。果蝇中只存在一种HH基因，而在脊椎动物中至少发现3种同源基因，即Sonic hedgehog(SHH)、Indian hedgehog(IHH)和Desert hedgehog(DHH)，分别编码3种相应的蛋白：Shh、Ihh 和Dhh。膜蛋白受体包括Ptch(Patched)和Smo 受体。Ptch家族是一种十二次跨膜蛋白，起Hh受体作用。Ptch在人类中有2个同源基因：Ptch1、Ptch2分别编码Ptch1、Ptch2蛋白。二者均能与3种Hh蛋白结合，并且亲和力相似。Smo是一种起信号转导子功能的7次跨膜蛋白。Gli为核转录因子，在人类有3种亚型，即Gli1、Gli2 和Gli3，三者功能各不相同。Gli1有激活功能，Gli2 表现为Hh靶基因的激活与抑制子，Gli3也可作为Hh信号的激活子与抑制子，Hh信号通路便是通过调节下游的Gli 转录因子控制靶基因的表达的。

初级纤毛是由微管构成的发生于哺乳动物细胞表面的突触样结构。很多文献证实，初级纤毛是Hh信号转导的必需条件。在哺乳动物细胞中，Hh信号通路的Ptch、Smo及下游转录因子Glil、Gli2和Gli3均存在于初级纤毛上。配体激活的Hh信号通路促发SuFu和Gli蛋白复合体发生细胞内易位，最终到达初级纤毛顶部，SuFu的抑制作用解除，Gli被释放，易位到胞核，作用于靶基因，表明初级纤毛在这一过程中的枢纽地位[2]。另有文献报道，Hh通路激活的过程如下：无配体时，受体Ptch1定位于初级纤毛，阻止Smo的进入，抑制性Gli蛋白易位到细胞核，无法激活靶基因。配体结合Ptch1后,Hh-Ptch1复合体内在化，Smo易位到初级纤毛，活化性Gli蛋白易位到细胞核，最终靶基因开始转录，这些是Hh通路自身成员；另外，众多与促增 殖(如D-及E-型细胞周期蛋白)、抑制凋亡(如BCL2)或干细胞活化(如NANOG)相关的基因被激活。

二、 Hh信号通路的激活模式

关于肿瘤中Hh通路的激活至少已提出了3种模式。第一种为非配体依赖型模式：Hh通路任一水平发生突变均可以引起肿瘤发生。例如，当通路的负调节因子如Ptch[3-4]基因发生失活突变或功能性缺失或正调节因子如Smo[5]发生功能获得性突变导致Ptch对其抑制作用失敏均可以激活该通路。第二种模式为配体依赖型模式：认为配体发生异常过表达，以自分泌、旁分泌或逆分泌方式作用于Ptch受体，导致Hh通路的激活。第三种模式为非经典的肿瘤干细胞模式，认为Hh信号的激活存在于肿瘤干细胞(CSCs)内，负责干细胞的自我更新，从而促进肿瘤的增殖、侵袭和转移[6]。

三、 Hh信号通路与胰腺癌

1．Hh信号通路与胰腺癌的发生、发展：Hh信号通路的激活与胰腺癌有着密切关系。Thayer等[7]发现，在小鼠的发育过程中，Shh的异常表达可引起类似于人胰腺癌的早期病变。在胰腺癌早期及癌前病变阶段即可检测到Hh信号通路的激活。对不同时期的胰腺上皮内瘤变及胰腺癌进行分析，发现随着上皮内瘤变向胰腺癌的逐步发展，病变组织中Hh信号通路成员的表达水平也急剧上升。对54例胰腺癌标本进行检测，发现Ihh、Ptch、Smo蛋白均呈高表达，相应癌旁组织中只有胰岛细胞表达，在正常胰腺导管组织中均未见表达[8]。Quint等[9]发现，Shh、Ptch和Glil蛋白在胰腺癌组织中呈低到中度表达；在胰腺上皮内瘤变中，随着病变进展，Shh，Ptch和Gli1蛋白的表达量呈非线性增加； Shh、Ptch和Gli1蛋白的表达与临床病理特征(如淋巴结转移，肿瘤大小)存在显著的相关性。综上所述，胰腺癌组织及其癌前病变中存在Hh通路的异常激活，Hh通路参与了胰腺癌的发生、发展。

2．Hh信号通路与胰腺癌肿瘤相关间质：近年来，胰腺癌与其周围间质的相互作用受到广泛关注，其中Hh信号通路也发挥重要作用。研究证实Shh是引起胰腺癌中结缔组织反应的重要递质，主要由肿瘤细胞分泌，以旁分泌作用模式促进肿瘤间质的形成，同时也作用于胰腺癌间质细胞[10]。胰腺导管腺癌(PDAC)的特征之一是癌旁结缔组织增生，这是上皮组织来源的Hh配体旁分泌作用于间质引起的。胰腺上皮癌细胞可能通过分泌Hh配体激活了胰腺星状细胞(PSCs)，而它又分泌了一些可溶性因子反作用于癌细胞，增加其活性[11]。Olive等[12]证实Hh的小分子抑制剂可以引起明显的间质消退，提高原位胰腺癌小鼠模型的给药效率。同样，Lauth等[13]最近发现了在肿瘤相关间质细胞中存在Hh通路目的基因Gli1过表达，而在肿瘤中表达极少，与Hh通路在间质高活性而在肿瘤低活性一致。Shh诱导的旁分泌信号还可通过初级纤毛中的功能复合体引起间质分子改变(VEGF、MMP9表达上调)，促进血管生成、淋巴管生成和肿瘤转移[14]。总之，Hh信号通路通过肿瘤间质相互作用提供有利于癌细胞生长的微环境从而加速胰腺癌的发生。

肿瘤微环境是由细胞外组分构成的致密混合物，包含细胞外基质(ECM)、成纤维细胞、PSCs、炎症细胞、机制金属蛋白酶等。其中，PSCs被认为是ECM的主要来源细胞，肿瘤来源的Hh信号可以作用于PSCs，而PSCs对胰腺癌细胞也有反作用。体内实验已证实PSCs对胰腺癌有促进作用。PSCs可使胰腺癌细胞株的迁移明显增加，并促进其增殖、抑制凋亡；在动物模型上，共注射PSCs和胰腺癌细胞后，肿瘤生长更快，局部播散发生率增加，肝转移发生率也增加[15]。以上研究证实，Hh通路通过介导肿瘤间质相互作用，促进胰腺癌的发展。

3．Hh信号通路与胰腺癌干细胞：肿瘤干细胞(CSCs)与肿瘤的发生、侵袭、转移及肿瘤的放化疗耐药性密切相关。研究发现Hh通路参与了CSCs的功能维持、自我更新等过程，Hh通路的异常活化可以引起CSCs的增殖和肿瘤的复发。胰腺癌患者体内分离出的CD44+CD24+ESA+CSCs中Shh的表达明显高于其阴性三倍体对照[16]。Gli1的表达也与CSCs的代表特征之一——化疗抵抗性有关[17]。另外，体内和体外实验发现，Smo抑制剂可以促进CD133+胰腺癌干细胞的消退[18]。环巴明也可以通过阻断Hh通路抑制胰腺癌干细胞的自我更新[19]。

4．Hh信号通路与上皮间质转化：上皮间质转化(EMT)的特点是上皮标志性蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)等表达降低并定位于细胞膜上，以及间质标志性蛋白波形蛋白等表达增加。EMT可以增强肿瘤的侵袭力，促进肿瘤的转移和发展。近年来，研究提示Hh通路可以诱导肿瘤的EMT过程。

EMT过程中的重要转录因子Snail可能为Glil蛋白的下游转录调控靶点。Li等[20]研究发现，Hh信号通路转录因子Gli1通过诱导Snail的活性，从而抑制E-cadherin的表达，诱导EMT发生，促进肿瘤侵袭和转移。Feldman等[21]也报道胰腺癌中Hh通路下游因子Gli1过度表达可促进Snail表达上调，使E-cadherin表达明显下调，促进EMT的发生，导致肿瘤细胞侵袭性和转移性增高；使用环巴明后，Snail水平明显下调，而E-cadherin表达水平明显上调，肿瘤的侵袭能力明显减弱。通过Shh基因敲除或使用Hh通路抑制剂可以削弱肿瘤中具有EMT表型的细胞的侵袭力[22]，也提示Hh通路的活化可以诱导EMT及其后的癌细胞侵袭。另外，Shh基因敲除也可以明显抑制TGF-β1诱导的EMT过程[22]。使用Hh通路抑制剂可以逆转细胞的EMT表型，表现为间质标记物ZEB1及纤连蛋白减少，上皮标志性蛋白E-钙连素增加[22]。许多研究也发现Hh通路与TGF-β、Notch、WNT和Ras通路及生长因子受体可能共同参与EMT过程。这些结果证明Hh信号通路活化与EMT表型的获得及肿瘤侵袭有关。

5．胰腺癌中Hh信号通路与其他通路的相互作用：Hh通路与许多通路之间存在交叉对话，构成一个庞大精密的网络调控胰腺癌的发生、发展和转移等过程。

TGF-β激活激酶-1(TAK1)是MAPK家族成员之一，也是炎症免疫、应激反应及肿瘤发展过程中许多信号转导连锁反应的关键调控因子，它可以通过激活细胞外激酶如p38MAPK、JNK及IKK最终诱导转录因子NF-κB活化。研究发现，TAK1通过活化NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)参与胰腺癌对化疗药物的耐受性，基因沉默或抑制TAK1是逆转胰腺癌内在耐药性的有效方法[23]。TAK1的泛素化也参与调控抗肿瘤药物阿霉素诱导的NF-κB活化，从而影响阿霉素的抗癌作用。TAK1参与多种形式的NF-κB活化。TAK1对于TNF-α[24]及基因毒性因素诱导的NF-κB活化都具有调控作用。而Shh是NF-κB的直接转录靶点。研究发现NF-κB p65和Shh在胰腺癌组织标本中的表达呈显著正相关，阻断NF-κB可以抑制Shh mRNA的表达[25]。某些炎性因子(如IL-1β、TNF-α等)可通过激活NF-κB导致Shh的过度表达，进而激活Hh信号通路，并影响细胞周期蛋白的表达，促进胰腺癌细胞的增殖。以上研究提示，在胰腺癌中TAK1-NF-κB的激活是引起Shh高表达的机制之一，TAK1-NF-κB引起胰腺癌细胞增殖一定程度上是通过Shh高表达实现的，两条通路间存在相互作用。

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤微环境的重要成分之一，在胰腺癌的发展进程中也发挥重要作用。依据激活方式的不同，分为M1和M2型TAM，近年来，M2型TAM在胰腺癌进展中的作用受到研究者的重视。M2型TAM影响PDAC淋巴转移，与其预后相关，抑制TAM与癌细胞的相互作用可以改善患者预后[26]。之后，又有文献报道M2型TAM与胰头导管腺癌的肿瘤大小、淋巴结转移和预后不良相关[27]。TAM促进胰腺癌发展的机制之一便是TAM中NF-κB活化，可以促进促肿瘤因子的分泌，从而影响肿瘤的发展。有研究者提出设想，在炎症刺激如LPS作用下，NF-κB诱导TAM活化，直接或间接通过Shh的分泌诱发和促进PDAC的发生[28]。以上研究提示，TAK1-NF-κB、TAM、Hh通路在胰腺癌的发生中都发挥重要作用，在这个过程中三者之间相互作用，组成复杂的环路而参与胰腺癌的进展。

Pasea di Magliano等[29]采用一种可特异性激活胰腺上皮细胞中Hh信号通路的小鼠模型研究胰腺癌的发病机制，发现小鼠生长到成年后可形成胰腺未分化癌，通过激活Ras信号通路可进一步诱导形成胰腺上皮内瘤变并提高肿瘤致死性，提示特异性激活胰腺上皮细胞中Hh信号通路可以诱导胰腺瘤变。Ras和Hh信号通路共同参与胰腺导管腺癌的形成。研究证实，Ras通路异常通过RAF/MEK/MAPK级联反应促发上皮内瘤变及晚期胰腺癌Hh通路的活化。另外，Shh可以减少肿瘤细胞对活化的Ras信号的依赖性[30]。

Yamazaki等[31]用Shh转染的胰腺癌细胞的上清液培养内皮前驱细胞，结果发现其可诱导血管内皮生长因子(VEGF)、间质细胞衍生因子-1(SDF-1)和血管形成素-1(Ang-1)mRNA表达水平的上调，但以上这些生长因子与Hh信号通路相互作用的具体机制尚待进一步研究。采用靶向Shh的治疗既可以抑制肿瘤细胞的增殖，也可以抑制肿瘤血管的生成。但也有报道使用Hh通路抑制剂有促进肿瘤血管生成的作用[11]，这个问题还有待进一步研究。

在胚胎发育时期，Notch信号通路和Hh信号通路共同参与调控胰腺发育，Shh的表达与否决定了细胞发育的终点；Notch 信号通路与胰腺前体细胞的自我更新和分化相关。Notch信号通路的异常激活可影响胰腺前体细胞向各种胰腺细胞系的发育。在成熟胰腺组织中，以上两种信号通路都处于失活状态，二者的异常激活将导致胰腺癌的发生。

在肿瘤干细胞中存在着一个由Hh、BMP /TGF-β、FGF、WNT和Notch信号通路共同构成的信号网络，在胰腺癌发生中发挥关键作用。而上述通路的协同作用在EMT过程中也发挥重要作用。

上述研究提示，Hh通路与其他通路存在广泛的相互作用，共同促进胰腺癌的发生、发展。

四、阻断Hh信号通路在胰腺癌治疗中的研究

Hh信号通路与胰腺癌的发生、发展、侵袭和转移关系密切，理论上，阻断Hh是胰腺癌治疗的有效途径。近年来，一些Hh通路的小分子抑制剂已用于实验室或临床研究，包括阻断Shh和受体结合，如Robotnikinin、Shh抗体5E1；拮抗Smo，如环巴明(cyclopamine)、KAAD-cyclopamine、SANTs1-4、Cur-61414、GDC-0449、BMS-833923、IPI-926、LDE-225和PF-0444913等；作用于Smo下游位点，如HPI1-4、GANT-58 和GANT61等[32]。在这些抑制剂中，许多成员对肿瘤的抑制作用已得到证实。环巴明可以逆转Hh信号通路依赖性细胞株对吉西他滨的耐药性，并下调这些细胞株CSCs标志物的表达。环巴明也可以抑制胰腺癌细胞株snail、E-cadherin上调，抑制EMT，并伴有原位瘤明显缩小[33]。IPI-926可以诱导胰腺癌小鼠模型间质的消退，提高吉西他滨化疗药物的疗效[12]。smo的抑制剂AZD8542通过阻断Hh信号通路作用于小鼠肿瘤模型的肿瘤相关间质，抑制肿瘤增殖和转移[11]。

但这些药物的不良反应也不容忽视，所以一些相对无毒副作用的天然制剂引起了研究者的注意，如大豆异黄酮、白藜芦醇、绿茶多酚、姜黄素、维生素D等，它们可以有效阻断Hh信号通路及其他通路，阻止胰腺癌的进展[34]。这些营养制剂可以与传统的化疗药物联合应用，提高肿瘤治疗的效果。

Hh信号通路的激活在胰腺癌中是广泛存在的，与胰腺癌的发生、发展、侵袭、转移相关。Hh信号通路抑制剂对胰腺癌的抑制作用也得到证实，但是，研究显示单一靶点Hh通路抑制剂治疗后存在快速耐药现象，提示Hh通路抑制剂的联合应用是更合理的选择。另外，我们应该注意，Hh通路与众多其他通路存在交叉对话。除了经典的激活方式，其他通路也可以介导Hh通路的活化。这种情况也造就了Hh通路抑制剂的获得性耐药，所以，Hh与其相关通路的联合靶向治疗有望为胰腺癌的治疗提供新的策略。在不同的肿瘤个体，发病的分子机制可能有所不同，因此，通过基因测序、免疫共沉淀等手段明确这些个体中Hh通路及其他通路的活化状态，进而进行分子分型，确定个体化的治疗方案，将是未来胰腺癌治疗的关键。

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(本文编辑：吕芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.01.020

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

李兆申，Email： zhsli@81890.net

2012-11-26)