胰腺癌上皮间质转化的研究现状与进展

常志刚 田孝东 杨尹默

·综述与讲座·

胰腺癌上皮间质转化的研究现状与进展

常志刚 田孝东 杨尹默

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转化的现象，其定义为具有极性、紧密连接特性的上皮细胞转换成独立的、具有移行能力、并能侵入细胞外基质的间质细胞的过程。EMT的概念最早见于发育生物学，主要参与胚胎的发育、组织重建、创伤愈合、心瓣膜和颅面结构以及肌肉骨骼系统的形成，同时与多种慢性疾病(如肾纤维化)的发病机制密切相关。近年来研究还发现EMT过程与肿瘤细胞的生长、浸润及转移密切相关。参与调控肿瘤细胞EMT过程的信号通路及相关基因的研究日益受到重视，成为肿瘤研究的热点[1]。研究表明，经过EMT，肿瘤细胞在功能上增强了移行能力、基质重塑能力及抗凋亡能力，该过程还包括细胞形态学及基因型的改变[1-3]。而EMT的发生与多种蛋白分子、微环境及micro RNA等相关，涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制。

一、EMT的关键分子：E-钙黏素

钙连接素是上皮组织中的一类依赖Ca2+的细胞间跨膜粘连糖蛋白分子，主要参与细胞间的连接，分为E-钙黏素、P-钙黏素和N-钙黏素，其中E-钙黏素对肿瘤侵袭转移的影响最为重要，同时也是EMT的关键分子。E-钙黏素可与β-连环素(β-catenin)和γ-连环素(γ-catenin)结合，再与α-连环素(α-catenin)相连，形成E-钙黏素-β-连环素-α-连环素复合体[4]，此复合体再直接连接到肌动蛋白细胞骨架上，用以维持细胞间黏附的稳定性和细胞极性。细胞连接复合体还直接或间接参与细胞的信号转导，对胚胎发育中的细胞识别、迁移、组织分化以及肿瘤的发生、发展和转移具有重要作用。在上皮细胞发生间质表型转化以及肿瘤发生过程中，经常会发现E-钙黏素表达下调或E-钙黏素-连环素复合物功能的失调。E-钙黏素表达下调或抑制可以启动EMT，并导致肿瘤的浸润及转移。E-钙黏素的表达与肿瘤的侵袭能力呈负相关。染色体丢失、基因突变或E-钙黏素启动子的甲基化都可以降低E-钙黏素表达水平。E-钙黏素缺失的细胞侵袭性增加，在动物模型中可以引起腺瘤向腺癌的转化[4]。

二、胰腺癌EMT的诱发因素

多种生长因子可调控EMT，如血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factors, VEGF)、转化生长因子β(transforming growth factor, TGF-β)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMP)等。生长因子与上皮细胞表面相应受体结合，通过细胞内的Ras、Src、Rho、PI3K、Wnt等信号转导途径将信号转入细胞内，活化不同的核内转录因子，调节转导基因的表达，最终促进EMT的发生。

1．TGF-β：TGF-β有3种异构体TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，均属于结构相关的生长因子超家族，3种TGF-β均可诱导EMT。TGF-β与其受体TβRⅠ、TβRⅡ和TβRⅢ的β聚糖结合，磷酸化Smad 2和Smad 3，进一步与Smad 4结合，转移入细胞核活化转录基因。也可以通过非Smad分子依赖途径发挥作用，包括GTP酶介导的信号转导途径、p38 MAPK途径、PI3K途径、TIF-1γ(transcriptional intermediary factor-1γ)等发挥作用。

TGF-β是胰腺癌发生EMT的主要诱导因子之一，免疫组化检测发现41.4%的胰腺癌患者表达TGF-β1，血清TGF-β表达增高与胰腺癌的预后相关。体外研究也证实TGF-β1促进胰腺癌PANC1细胞发生EMT及侵袭[5]。在含有活化KrasG12D等位基因的胰腺癌小鼠的体内实验研究中发现靶向抑制TGF-β信号通路下游分子可消除EMT，癌细胞出现囊性、腺体样分化较好的表型，且几无转移能力[6]。

通过建立TGF-β诱导EMT相关转录基因高表达的PANC1细胞，发现表达显性阴性的HrasS17N突变的细胞系无EMT相关转录反应，而表达持续活化的KrasG12V突变的细胞EMT相关基因表达增加[7]。利用特异性MEK1抑制剂PD98059(特异性抑制细胞外信号调节激酶ERK-1和-2的活性)干预PANC1、Colo-357和IMIM-PC1细胞系，发现细胞运动、侵袭能力增加并伴随中度持续性ERK2活化。上述发现提示Kras介导活化MEK-ERK信号途径在TGF-β诱导的胰腺癌EMT中起着重要作用。

Gordon等[8]研究发现，胰腺癌细胞发生EMT过程中伴随Ⅲ型TGF-β受体(TβRⅢ)下调，提示TβRⅢ对EMT起负调节作用。作者发现TβRⅢ缺失是TGF-β诱导EMT发生的必要因素，TβRⅢ表达缺失可能是胰腺癌细胞发生EMT的关键事件。

2．HGF：HGF是c-Met原癌基因跨膜酪氨酸激酶受体的配体。HGF及其受体c-Met在人类胰腺癌组织中呈高表达，且HGF可通过c-Met途径促进胰腺癌Colo-357细胞系的侵袭[9]。稳定敲除人胰腺癌SUIT-2细胞系HGF活化抑制剂-1基因(HGF activator inhibitor-1, HAI-1)可诱导EMT，并伴随SIP1/ZEB2(Smad-interacting protein 1，Smad相互作用蛋白1)表达增加，E-钙黏素表达下调；相反HAI-1过表达则可增加E-钙黏素的表达并恢复上皮表型[10]。

c-Met相关酪氨酸激酶受体RON/MSTR1在93%人类胰腺癌组织中呈高表达，且在所有人类胰腺癌细胞系中均有表达[11]。体外研究[11]用RON配体MSP/MST1(巨噬细胞刺激蛋白macrophage stimulating protein)处理胰腺癌L3.6pl细胞，可使该细胞发生EMT，伴随ERK磷酸化增加、E-钙黏素表达下降、β-catenin核内转位、细胞侵袭运动能力增加等。相反，同时应用RON单克隆抗体孵育，则可抑制L3.6pl细胞的运动和侵袭。在裸鼠体内实验应用RON单克隆抗体可显著抑制皮下及原位肿瘤的生长。因此RON和c-Met均可作为HGF诱发胰腺癌细胞侵袭的潜在治疗靶点。

3．BMPs：BMP家族中，BMP-2、BMP-4和BMP-7可以诱发PANC1细胞的EMT，如下调E-钙黏素、增强细胞运动和侵袭能力等，其提高侵袭能力的作用机制可能是由于增强了基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达和活性[12]。BMP可下调胰腺癌进展过程中TβRⅢ的表达，该过程需要Smad1参与[12]。BMP4可诱导同源框基因MSX2的表达，后者与胰腺癌的EMT相关，灭活MSX2基因则可抵消BMP诱发的EMT，因此BMP4可通过诱导MSX2基因引起EMT改变从而促进胰腺癌的进展。

4．VEGF：VEGF-α和VEGF-β通过结合受体VEGFR1促进细胞运动、侵袭及EMT。用VEGF蛋白处理L3.6pl细胞，后者呈纺锤形改变，并失去细胞极性，出现伪足[13]。VEGFR1交联可促进E-钙黏素及β-catenin分别向细胞质及细胞核转移。激活VEGFR1可下调E-钙黏素和盘状球蛋白(plakoglobin)的表达，并上调间质标志物如波动蛋白、N-钙黏素以及EMT相关转录因子Snail、Twist和Slug等的表达。

三、EMT相关信号转导通路

1．SMAD/STAT3通路：到目前为止，Smad通路是研究最为透彻的TGF-β下游信号通路。Smad蛋白超家族由受体调节Smad1～7组成。TGF-β与受体结合后，Smad 2和Smad 3通过其C末端SSXS模体磷酸化而活化，进而与Smad 4形成同型及异型复合物转移进入细胞核而调节目的基因的转录。灭活编码Smad4蛋白的DPC4基因可抑制TGF-β介导的EMT，进一步抑制KrasG12DInk4aKO鼠胰腺癌细胞的侵袭和转移[14]，并出现上皮形态和结构、上皮标志物细胞角蛋白-19的持续表达及间质标志物波动蛋白的下调等。

Zhao等[15]研究发现，STAT3是胰腺癌EMT的必要因子，Smad4对STAT3诱发EMT起负调节作用。敲除Smad4则可致STAT3的异常激活，使TGF-β促肿瘤通路占优势[15]。与STAT3在胰腺癌EMT中的关键作用一致，其下游因子LIV-1可调节EMT关键因子Snail的核转位。敲除LIV-1的PANC1细胞Snail核转移减少、E-钙黏素上调，且细胞运动和增殖能力下降，裸鼠成瘤实验发现肿瘤生长及转移能力下降。

2．Ras/ERK1/2通路：K-ras突变在人类胰腺癌中广泛存在。利用胰腺特异性弹性酶-1和Pdx1启动子将等位基因K-rasG12D转入小鼠胰腺，小鼠发生胰腺导管内瘤性病变(pancreatic intraductal neoplastic lesions，PanINs)，其中25%进展为侵袭性胰腺癌。导入Pdx1-KrasG12D等位基因同时敲除p53或者p16/p19Ink4a可致其充分癌变，并100%具有侵袭性，动物模型在12周内死亡[14]。研究还发现RasG12V或ERK2的过表达可致MCF-10A乳腺癌细胞发生EMT[16]，用shRNA敲除ERK2后可抵消RasG12V诱导的EMT，提示两者之间存在相互作用。在胰腺癌中ERK的活化与EMT呈正相关，且与患者的预后相关。BMP4诱导MSX2同源框基因依赖于ERK和p38 MAPK通路的激活以及Smad蛋白的表达[17]。

3．转录因子：SNAI1/Snail、SNAI2/Slug、ZEB1/δEF1/ZFHX1A、ZEB2/SIP1/ZFHX1B、TWIST1/TWIST以及TWIST2/DERMO1均是EMT的重要调控因子，主要通过抑制CDH1/E-钙黏素来促进肿瘤相关的EMT，其次尚可调节一些上皮细胞相关基因的表达，如Claudins、Cytokeratins、Cadherins、Occluding以及ZO蛋白等[18]。

Snail是一种含有锌指结构的DNA结合蛋白，与SIP1竞争性结合E-钙黏素启动子部位的E-box连接基序，抑制基因的表达，促进波形蛋白(Vimentin)表达上升，引起上皮细胞向间质细胞表型转变[19]。在MDCK(madin-darby canine kidney) 上皮细胞中，Snail与E-钙黏素的表达呈负相关，缺乏E-钙黏素的癌细胞出现大量的Snail，将Snail转染至E-钙黏素阳性的细胞可以导致细胞E-钙黏素表达水平的下降，并表达出波形纤维蛋白等间质标记物，从而导致细胞EMT的发生[2]。Snail调节的靶基因数目众多、功能广泛，被称为细胞EMT的“开关”。

Slug和Snail同属于锌指蛋白Snail超家族，在鸡原肠胚形成过程中，Slug也可以下调E-钙黏素的表达[1]。

四、微环境与细胞外基质

上皮细胞从同类细胞之间以及基底膜上的解离与周围基质的重构关系密切。细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)在细胞转移过程中起重要作用，间质表型更易与细胞外基质发生黏附。细胞外基质及其相关酶类的改变，可以导致细胞增殖、外形改变并获得转移能力。由于ECM是间充质细胞分泌的，因此，上皮细胞分泌ECM可以看作其向间质细胞转化的一个证据。同时，发生EMT改变的细胞会分泌大量的ECM及其酶类，这可促使其从原位逸出。

MMPs是一类锌肽酶超家族，具有降解ECM成分的能力，是目前已知唯一能降解胶原纤维的酶类。胶原蛋白、层黏连蛋白、纤维连接蛋白等都是它的作用底物。肿瘤细胞本身表达MMPs的同时还能直接刺激宿主成纤维细胞大量表达MMPs。在胰腺癌PANC1细胞中研究发现，BMP可通过MMP-2促进细胞EMT，增加侵袭能力[20]。

五、MicroRNA

MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约18～24个碱基的非编码单链小分子RNA，在转录后水平调控基因表达。主要通过与mRNA 3′非翻译区域配对，抑制翻译和(或)促进降解。miRNAs在细胞增殖、分化、凋亡、基因调控及疾病的发生中扮演重要的角色。

最先在MDCK细胞中，发现miRNAs在EMT用TGF-β诱导或者蛋白酪氨酸磷酸酶Pez过表达引起的EMT中起调节作用[21]。EMT与miR-200、miR-205表达下调有关。miR-200b、200a、429的持续表达可以完全阻止TGF-β诱导的MDCK细胞发生EMT。此外，多项研究[21-22]显示，miR-200家族(如miR-141、miR-200c)可显著下调TGF-β对EMT的作用，miR-200直接作用于(抑制)ZEB1及SIP1的mRNA，上调胰腺癌细胞系中E-钙黏素的表达，抑制EMT的发生。Brabletz等发现在胰腺癌细胞EMT中，ZEB1可下调miR-200家族成员miR-141和miR-200c的表达，而ZEB1和TGF-β又是miR-200家族的靶基因，提示它们之间存在负调节反馈环。

其他的一些miRNA如miRNA-10b可以上调HOXD10基因的翻译、下调RhoC的表达，从而促进肿瘤的侵袭和转移，而Twist可以促进miRNA-10b的转录[23]。另外在人类皮肤癌角化细胞中发现了一种EMT特异性miRNA：miR-21。目前认为miR-21是一种肿瘤基因，可以抑制原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPM1)和程序性死亡4基因( PDCD4)两种抑癌基因的表达，从而抑制细胞凋亡。

综上所述，EMT在胰腺癌的发生、发展中起着关键的作用，与多种蛋白分子、微环境及miRNA等相关，并涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制。近年研究表明，吉西他滨、5-氟尿嘧啶和顺铂的耐药与胰腺癌细胞的间质细胞表型相关[22]，并与调节因子ZEB1和Notch-2等调节因子相关。研究胰腺癌的EMT有可能为胰腺癌的辅助治疗提供潜在的药物靶点。

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2012-08-06)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.020

国家自然科学基金资助项目(81172184)

100034 北京，北京大学第一医院外科(常志刚、田孝东、杨尹默)；卫生部北京医院外科(常志刚)

杨尹默，Email:yangyinmo@263.net