胸腹水癌细胞形态学检验诊断的实践与体会

梁华兵，卢兴国

(1.浙江温岭市第二人民医院检验科，浙江温岭317502;2.浙江大学医学院附属第二医院血液科，浙江杭州310009)

胸腹水脱落肿瘤细胞学检验诊断，长期来是检验医学中的弱项，其原因有三:其一为出版的相关专著绝大多数是用病理学方法和视角介绍的，不太适用于检验医学的细胞形态学诊断;其二是检验医学(包括院校)对胸腹水脱落细胞学检验诊断的基础、技能教学(育)和培养的投入不足;其三是胸腹水肿瘤细胞学，即使同一病例标本，常表现千姿百态形态，评估性诊断时，又需要一定的临床和病理为基础，故普遍性重视不够。临床上，恶性胸腹水中，最常见的是癌细胞侵犯，包括儿童患者［1］，但对胸腹水标本送检的要求、处理的方法、镜检的要求和形态学的把握等，文献上报道的体会均有所不同［2～7］。现将我们13年来的一些实践探索与体会作一介绍。

一、材料和方法

1.病例 1999年1月至2011年10月浙江温岭市第二人民医院住院患者，经CT、B超和肿瘤标志物或病理组织学和(或)脱落细胞学等检查而明确诊断的恶性肿瘤患者，临床最后汇总各项检查而确诊的癌性胸腹水939例。其中男504例、女435例，年龄34～89岁;肺腺癌浸润450例，肺鳞癌20例，肺小细胞性癌13例，胃癌171例，卵巢癌111例，胰腺癌85例，肝癌25例，乳腺癌18例，大肠癌16例，其他癌症转移30例;胸腹水细胞学检查找到癌细胞409例，阳性率为43.6%。

2.标本处理 抽取的胸腹水由乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝剂塑料带盖标识专用试管抗凝(容积11 mL)，常规标本在0.5～1 h内280×g离心5 min，离心后倾去上清液，推片或涂片，Wright-Giemsa混合染色和细胞免疫化学染色(SP法)［4］，晾干后镜检。实验标本放置时间和处理方法见结果。

3.观察方法和形态学评判 观察标本不同的处理方法、推片量与涂片法、标本放置时间、镜检方法和技巧以及掌握癌细胞形态对癌细胞检出率的影响。回顾性观察的阳性标本由2位专职学形态学检验医师进一步确认。本实验室规定的几个细胞形态学定义或依据如下:细胞空泡形成是指胞质有1个或多个空泡出现者，细胞退化是指细胞比正常为大并出现胞膜溶解和(或)染色质结构模糊不清者;将细胞过大且胞核幼稚和畸形或胞质染色浑厚者，核仁大而蓝染者和核形异常者，类似造血原始细胞而胞质偏位与囊泡和(或)小簇出现者，中大型细胞核背靠背或结对现象且胞质异常者，中大型细胞组成团状、套叠现象和囊泡状胞质结构者等，作为基本符合或提示癌细胞的依据;将其中胞质囊泡状和(或)染色不均匀性、细胞嵌合状和(或)套叠状，以及上皮样结构(如腺管状和较规则状细胞聚集一起)形态特征者，作为进一步评判基本符合或提示腺癌细胞的依据;将间皮细胞样、大或巨大而散在性分布的癌细胞，常有多变形胞质和圈曲样细胞团或角化珠样结构者，作为进一步评判基本符合或提示鳞癌细胞的依据。

4.统计学方法 百分比数据，组间比较用SPSS12统计软件包进行χ2检验。中位数组间比较用秩和检验。

二、结果

1.标本处理方法对癌细胞检出率的影响(1)留取细胞沉渣方法:标本离心后去上清液有2种方法。习惯方法在离心后将试管内上清液倒掉，试管内残留细胞液量平均达到100 μL甚至更多，制成的推片有核细胞往往不足。另一方法，是将经过离心的试管管底细胞沉渣端向里，一手持离心管缓慢弃去上清液，至80℃ ～90℃左右保持30 s，另一手持棉球吸去残液。使沉渣残留量浓缩至平均50 μL以下。我们在开展胸腹水癌细胞检验诊断的前7年，用前一方法处理临床确诊的411例癌性标本，152例找到癌细胞检出率为37.0%;而后6年采用后一方法制备标本528例，257例找到癌细胞，检出率48.7%，后组比前者提升较为明显(χ2=12.85，P＜0.01);(2)推片标本量:对39例临床诊断的癌性标本，分别制成3 μL和6 μL的普通推片和加厚推片，各3张。厚推片组17例(43.6%)找到癌细胞，而普通推片组找到癌细胞14例(35.9%，P＞0.05)，而癌细胞偶见(每张涂片＜3个癌细胞)者，厚片组和普通推片组分别为2例(11.8%)和5例(35.7%)，显示加厚推片检出癌细胞有若干优势;(3)标本放置时间、温度与细胞形态:随机留取15例病例的非低蛋白血症漏出液，其中炎症性10例、癌性5例。留置每一患者胸腹水6例标本(6支专用试管)，分别在室温下放置0.5、1、2、3、4 和 16 h，分次离心留取沉渣推片，观察标本放置时间长短对细胞形态的影响。结果为0.5～2 h内处理的标本，细胞形态几乎一样;有1例标本至3 h时出现稍为明显的核固缩和碎裂，至4h和16h明显增多(表1)。空泡变性是胸腹水标本中最常见变化，在不同标本中空泡细胞悬殊(与标本性质有关);间皮细胞和癌细胞空泡放置3 h和4 h时的主要变化时空泡增大，甚至出现气球样大空泡(图1)。癌细胞和间皮细胞退化均少，放置16h后才见退化细胞增加。淋巴细胞变化最不明显，多数标本无异常形态，只2例见小空泡，退化细胞更少见，均不随时间而发生明显变化。在实验观察的13例中，至16h时仍有5例(38.5%)标本细胞形态与0.5h标本无异(P＞0.05)。

表1 不同放置时间胸腹水对细胞形态的影响(中位数，范围%)

图1 胸腹水放置后的细胞形态变化

另随机留取6例非低蛋白血症漏出液，每例一分为二。1例及时处理，另1例放置4℃冰箱12 h时处理。结果为放置4℃冰箱12 h标本与不放置4℃及时处理的标本，均未见出现明显的形态差异，包括细胞空泡(中位数37%与40%)、退化(中位数4%与4%)、核固缩和碎裂(1%与1%)，组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。

三、讨论

我们在实践中体会到，寻找胸腹水癌细胞最重要的是找到其。因此，要提高癌细胞检出率，浓缩细胞量的处理方法即是其中的一个因素。可通过多次离心的方法提高细胞量［8］，但这需要较多的标本量和抗凝问题，并增加操作步骤。我们用11 mL专用试管容积量，离心后，在倾去上清液的方法上做了调整，即试管倾斜80℃ ～90℃ 30 s并用一颗棉球吸去过多的余液，达到了浓缩细胞量的一个重要步骤，可使沉淀的残余液量比一般方法减少一半以上，同时又因细胞增加而容易制备满意的推片。此外，增加每一推片的量又是其中的一个因素。相对而言，标本中细胞越多越容易检出癌细胞，包括对检出癌细胞数量和检查费时的影响。我们将推片量由3 μL提高到6 μL，对个别癌细胞特别少的标本有明显影响。所以我们规定体液脱落细胞学检查制成的推片以厚片为佳，但必需有尾部。反复的实践表明，5～6 μL的加厚推片尾部区域，细胞结构基本清晰。经离心浓缩的加厚推片有3个优点:聚集大细胞于局部，检查费时少和易于找到并进一步评判癌细胞的上皮组织来源。推片的标本量中，还需考虑其中的红细胞过多对癌细胞检出的影响。红细胞明显增多时，常因离心后厚厚的红细胞层而影响残留细胞液量或所要求吸取白细胞层的细胞。此时，应将红细胞去除，可往离心管内加入适量的低渗氯化钾溶液(48 g/L氯化钾溶液)，破坏红细胞，再次离心后取沉淀物制片。也可用其他方法去除过多的红细胞［2］。

在胸腹水细胞学检验中，人们普遍关注的是细胞退化造成对诊断的影响，故要求胸腹水标本尽可能新鲜，但在送检的时间上尚缺乏一致的认识，可能也与缺乏一定的实验有关。我们将标本放置不同时间后观察表明，标本放置后，可观察到细胞空泡、退化、核碎裂和固缩形态的增加或发生。但通过实验发现放置2 h内处理的标本几乎不对细胞形态产生影响(前后形态几乎一致)，少数标本(1/13)在放置3h时出现核固缩和核碎裂增多，一部分标本(3/13)至4h出现细胞空泡增大和(或)增多。胸腹水标本真正的细胞退化只是一部分，较多的细胞形态改变都在标本获得时就存在，因此，加强对不同病理状态下的细胞形态识别十分重要。而且不同标本中的形态异常差异十分明显，也有部分是由于推片机械性因素造成的类似退化性变化(细胞过度摊开)，后者与血片尾部细胞的部分形态变化一样。在同一张标本中，当部分区域细胞退化而部分区域细胞结构清晰时，就可以评判为假性细胞退化。最容易发生空泡的是中性粒细胞和单核巨噬细胞，但他们通常对肿瘤细胞的形态鉴别不产生影响。最不易发生形态变化的是淋巴细胞，其很少出现空泡和退化，但淋巴细胞(尤其是肿瘤性)过多时则可在尾部出现涂抺细胞(推片所致机械性形变，个别标本很多)。最易发生退化的是间皮细胞和癌细胞，也是最易造成混淆者，而且放置后两者的形态变化类似，这才需要加强区别的。我们认为对形态学的把握是最重要的，癌细胞胞体和胞核多不规则、细胞大多大而异形或成簇、核仁大多大而明显、胞质多为丰富而染色不均，当癌细胞退化时仍会留有明显的恶性形态特点，尤其是胞核的畸形和大核仁，而退化的间皮细胞形态几乎与此相反，或显示出明显的不典型性改变，此外，还可结合细胞免疫化学染色作出鉴别。影响胸腹水标本细胞学改变的因素很多，除了人为影响外，有体液营养成分、体液渗透压与病因(肝硬化和肾病所致的漏出性胸腹水细胞很容易发生细胞退化和机械性形变)、体液细胞量和实验试管中标本量(标本量少易于形变)、温度、试管的不同材质(玻璃的易于细胞变化)等，而普遍关注的放置时间因素仅是其中之一。我们认为临床抽吸胸腹水后，用EDTA-K2抗凝剂塑料带盖标识专用试管抗凝的标本，在2 h内送到实验室并及时处理，可以作为胸腹水细胞学送检时间的规范要求。临床上，会遇到夜间抽吸的胸腹水需要送检。对此，我们还观察了4℃保存标本对细胞形态的影响，发现实验前、后无明显的细胞学改变，认为对临床来不及送检的夜间标本(专用试管盛放)，置于4℃冰箱次日及时送检和处理。

镜检标本区域对找到癌细胞的时间有影响，低倍和油镜是镜检的两个重要“武器”。镜检时先用低倍寻找可疑细胞而后转到油镜下确认，可以提高癌细胞的检出效率。低倍巡视除了尾部区域外，对推片边端和头部区域，也同样需要重视。推片的体部通常不予考虑，因此，部位厚而细胞结构不清，虽可检出异常细胞但常不易评判，这也是部分病理细胞学诊断中用涂(抺)片法阳性率低的原因。此外，我们规定对细胞少见的标本和阴性标本，必须检查所有染色的标本张数，至少3张;对临床高度提示的病例，需要染色更多的标本并更仔细地用低倍寻找的镜检方法。细胞免疫化学染色有较好的参考价值，建议有条件的科室尽量同步开展，有助于细胞学作出进一步的评估［9］。

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［3］丛玉隆.实用检验医学［J］.北京:人民卫生出版社，2009:304-315.

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［8］赵中华，刘 艳，林 云，等.二步离心法在浆膜腔积液常规细胞形态学检查中的应用［J］.江西医学检验，2007，25(1):70.

［9］黄卫彤，覃志坚，潘兴寿，等.胸腹水细胞学与组织学制片的免疫细胞化学诊断对比研究［J］.江西医学检验，2006，24(1):17-18.