免疫法检测瘦肉精的现状及其发展

李靖靖 郭 林

（中州大学化工食品学院，河南 郑州 450044）

免疫法检测瘦肉精的现状及其发展

李靖靖 郭 林

（中州大学化工食品学院，河南 郑州 450044）

免疫检测特异性好、分析速度快、成本低，在瘦肉精检测领域具有重要的应用价值。文章介绍胶体金免疫层析技术、酶联免疫吸附测定法及电化学、压电生物传感器等瘦肉精免疫检测主要方法的反应机理、技术特点、制作方法及相关的技术进展，指出目前研究中需要解决的问题并展望未来发展方向，认为开发新一代低成本、高灵敏度、高稳定性和高寿命的免疫传感器是快速实时及特异性检测瘦肉精残留较为理想的方法和途径。

免疫检测；瘦肉精；残留；检测方法

2011年央视3·15特别节目爆出的“瘦肉精”事件，再次引起中国国民对食品安全问题的关注。双汇集团的“十八道检验、十八个放心”唯独没有瘦肉精的检测，引起人们对瘦肉精检测方法进行深层次的思考。瘦肉精（clenbnterol bydrochloride or leanness enhancer）是盐酸克伦特罗（clenbuterol）、莱克多巴胺（ractopamine）、硫酸沙丁胺醇（salbutamol）、特布他林（terbutaline）和氨茶碱（aminophylline）类等具有增加瘦肉产率的作用的化学药品。这些在动物体内残留的“瘦肉精”通过食物进入人体，在人体积蓄中毒，会出现异常生理反应的中毒现象［1］。瘦肉精的残留已成为重大食品安全问题，因而，中国和欧盟严令禁止包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺在内的β－2肾上腺素能兴奋剂（β－2－adrenoceptor agonist）在动物生产中的应用。但是，目前非法滥用瘦肉精的情况依然严重。造成这种屡禁不止现象的原因：利益驱使某些商贩铤而走险；动物性食品的安全监督、检测机制不完善、不健全，或保障不得力；检测方法、手段不完善、不得力，达不到准确、方便、快速、经济的目标。

目前，国内外实验室检测瘦肉精残留最常用的方法是气相色谱－质谱法（GC－MS）［2，3］、高效液相色谱／质谱法（HPLC／MS）［4－7］、电 化 学［8－10］、毛 细 管 电 泳［11－13］、分 子 印迹［14，15］和免疫 分 析 技 术［16］。 而 免 疫 分 析 技 术 （immunoassays，IA）以其设备简单、操作简便、检测费用低而得到快速的发展和广泛的应用，网上热卖的“瘦肉精快速检测卡”更使免疫分析技术成为关注的热点，但是不科学不严谨的宣传又可能导致消费者的误读误用。文章就瘦肉精免疫检测的主要方法的反应机理、技术特点、制作方法及相关的技术进展作简要介绍。

1 胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）是由Osikowicz等［16］于1990年建立的一种新型快速、简便的检测方法，它以其不需要特殊设备和复杂操作过程的特点而得到迅速发展［17］。

1.1 基本原理

将胶体金标记的抗体或单克隆抗体的胶体金检测试剂沉淀到硝酸纤维素薄膜上制成标记垫（胶金垫），当含有目标检测物的待测样品（如尿液、血浆或全血等）加到胶金垫上，检测试剂被溶解并与待检样品一起沿薄膜条移动，样品中的待检物与检测试剂生成的结合物，在样品移动至固定有捕获试剂的区域时，产生特异性竞争结合而被截留，聚集在检测带上，通过肉眼观察到显色结果［18］。

1.2 技术关键

胶体金标记的单克隆抗体的制备：将瘦肉精中的盐酸克伦特罗、莱克多巴胺等没有抗原性的小分子物质（半抗原）与蛋白质等大分子载体共价结合所制成的单克隆抗体［19］与平均直径约为15nm的胶体金，通过正负间的静电吸附形成牢固的结合。将这个胶体金标记的单克隆抗体滴加在玻璃纤维膜上，干燥后可得胶金垫（conjugate pad）。

1.3 试纸卡（条）的组装方法

在塑料基板上，依次粘贴滤纸、样本垫、检测试剂垫（胶金垫）、硝酸纤维素膜和吸水垫，在两端粘上有颜色的覆盖膜，用BioDot裁切机切割成一定尺度的试纸条，装入检测卡中，再装入一袋干燥剂，热封口，4℃保存，试纸条组装流程示意见图1。

图1 试纸条组装示意图Figure 1 Schematic diagram of a test strip showing the components

1.4 产品特点

优点：操作简单、检测速度快，一般只需10～15min；无需其他仪器设备；样本量需求少；适用于大量样本的快速初步筛；检测费用低，一般10～20元／样本。

缺点：有时出现假阳性结果。

建议：出现阳性结果，应复检并用附带的瘦肉精阳性对照液作阳性对照试验，必要时可用GC／MS作定量检测。

2 酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫检测技术，是一种特殊的试剂分析方法。

2.1 基本原理

以酶或辅酶为标记物标记抗原或抗体，在合适的载体上，与相应的抗体或抗原进行特异性吸附，形成抗体抗原复合物，用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应，常见的EUISA类型有：双抗夹心、间接法和竞争法［20］。ELISA流程示意见图2。

2.2 技术关键

（1）瘦肉精单克隆抗体的制备。

（2）在固定相上包被瘦肉精单克隆抗体。

（3）酶标记的抗原。

（4）酶作用的底物。

图2 间接ELISA流程图Figure 2 Flow diagram of the enzyme－linked immunosorbent assay

2.3 操作过程

（1）加100μL稀释后的抗体到每个微孔底部，盖上盖板膜（避光），在8 ℃孵育过夜［21］。

（2）洗涤后，在各自的微孔中，分别加入100μL稀释后的酶标记物、20μL的标准液或处理好的样品液，在室温孵育1h。

（3）洗涤后，迅速加入50μL基质及50μL发色剂到微孔中，在室温暗处孵育30min。

（4）加100μL反应终止液到每个微孔中终止反应，混合后在450nm处测量吸光度值。

2.4 产品特点

优点：操作简单，无需其他仪器设备；样本量需求少；适用于样本的筛选；

缺点：有时出现假阳性结果；莱克多巴胺检测需将样品酶解还原后再进行检测，酶解过程需要较长的时间，每次分析至少需要3h，不利于快速检测；需要标记二抗。

3 生物传感器技术

生物传感器（biosensor，BS）是一种由生物识别元件和信号转换、放大元件共同构成的对生物物质敏感并将浓度转换为电信号进行检测的仪器。与传统的检测方法相比，生物传感器分析技术具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在线检测等优点，已经成为食品安全检测的重要手段 ［22，23］。

Zhu等［24］报道了一种应用竞争性表面增强拉曼散射（SERS）检测克伦特罗的免疫检测方法。该方法首先是将4，4′－联吡啶和待测样品和克伦特罗抗体分别结合在SERS纳米探针上，通过待测样品中的抗原和固定在基底上的抗原－BSA偶联物与结合在SERS纳米探针上的抗体竞争反应对克伦特罗进行定量检测的。该方法检测区间宽（0.1～100pg／mL）和较低的检出限量（0.1pg／mL）。Ji等［25］报道了一种基于 HRP（horseradish peroxidase）催化Luminol－H2O2化学发光反应，以对碘苯酚（4－iodophenol PIP）为增敏剂，通过待测样品中的抗原和抗原－HRP偶联物与结合在SERS纳米探针上的抗体竞争反应对克伦特罗进行竞争性毛细管电泳免疫化学发光定量检测的，检出限量1.2nmol／L。Lu等［26］报道了通过固定有莱克多巴胺衍生物的SPR－2004生物传感器芯片，检测生猪中莱克多巴胺残留的表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）生物传感器抑制免疫残留检测方法。检出限为0.6μg／kg，平均回收率为80%，相对标准偏差低于10%。这种方法简单快速，检测时间为5min，与ELISA方法比较，抗体无需标记。在相同的前处理条件下，与UPLC－MS／MS相比，回收率和精密度都较好，并且受样品基质的影响小，特别适合大量样品的快速筛选。Liu等［27］报道了以固定了莱克多巴胺－卵清白蛋白偶联物的SPR芯片为生物传感器，采用间接竞争法，测定生猪样品中莱克多巴胺的残留量，最低检出限为0.12ng／mL，线性范围为4.29～28ng／mL，IC50为1.17ng／mL。Traynor等［28］提出了表面等离子共振（SPR）免疫传感器应用于多种β－2肾上腺素能激动剂（β－agonists）残留快速检测，检测16个活体样品中的多种β－2肾上腺素能激动剂仅需1.5d，检出限量对于盐酸克伦特罗可达0.11ng／g，沙丁胺醇（salbutamol）达0.19ng／g，对于其他可达1.5ng／g以下。吕会田等［29］基于量子点标记的ATP合酶分子马达免疫旋转生物传感器（immuno－rotary biosensor，IRB），结合荧光技术，利用 BPCL弱光检测器实现了对盐酸克伦特罗快速、高灵敏度的检测，其感应灵敏度可达10－12g／L。肖红玉等［30］将抗体和辣根过氧化物酶包被到空白载体膜上制成的抗体膜固定到Nafion－二茂铁修饰玻碳电极，进行循环伏安扫描，实现快速（20min内）、准确（准确度达97%）和低成本地检测克伦特罗。线性范围为0.1～8.1μg／L，检出限为0.1μg／L。王秀玲［31］利用荧光CdSe／CdS量子点标记的克伦特罗抗原（抗原－QDs）和待测克伦特罗抗原同时免疫竞争核／壳型金磁珠Fe3O4／Au－克伦特罗抗体偶联物上，磁性分离后，通过检测清液中未与抗体相连的抗原－QDs荧光强度对猪肉中的克伦特罗，最低检出限为0.50pg／mL，线性范围是0.50～20 000ng／mL。黄渊等［32］利用微悬臂梁传感对瘦肉精进行非标记检测，发现该系统能够检测至少1μg／L浓度的瘦肉精标准样品，而且具有很强的选择性，在对照试验中加入不含瘦肉精的1mg／L氯霉素溶液没有响应。另外，瘦肉精抗原抗体的结合导致微悬臂梁产生压应力，而且微悬臂梁表面应力的改变与样品浓度的对数成线性关系。M.A.Cooper等［33］综述了2001～2005年间关于应用于生物分子间相互作用分析的石英晶体微天平生物传感器的文献。

免疫传感器方法具有简单、方便、快捷等优点，近年来，生物传感器研究已成为热点，但仍存在以下不足：特异性抗体或抗原的选择与制备难度大，研发成本高；感受器，或分子识别物采用的固定方法操作繁杂，实施成本高；检测的平行性较差，重复性不高，有时还会出现假阴（阳）性；处于实验室阶段，尚未有实用化的产品，无法现场检测。同时由于生物活性材料生存条件有限，长期以来生物传感器寿命、稳定性及制备的复杂性制约着研究成果商品化与批量生产［34］。笔者认为未来生物传感器的发展趋势和重点方向是微型化、多功能化、智能化和集成化，而特异性生物活性材料的选择、制备和固定化是免疫传感器制备的关键步骤。开发新一代低成本、高灵敏度、高稳定性和高寿命的免疫传感器是检测瘦肉精残留较为理想的方法和途径，也是今后的发展趋势。

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Advances and status in clenbnterol hydrochloride by immunosorbent assay

LI Jing－jing GUO Lin

（College of Chemical and Food Engineering，Zhongzhou University，Zhengzhou，Henan450044，China）

Immunosorbent Assay（IA）because of its specificity，fast response，low cost，plays an important role in the clenbnterol hydrochloride detection.This paper is presented as an overview of applications of colloidal gold immunochromatography，enzyme－linked immunosorbent assay and electrochemical，piezoelectric biosensors.The review includes the principle，characteristic，and manufacture of IA.Factors limiting the practical application of IA to analytical problems are also presented.This report assesses future directions for IA of clenbnterol hydrochloride and the following future trends are suggested：more sensitive detection，miniaturization，cheap，convenient，and increased functionality of surface treatments.The technique offers great potential to meet the need for rapid and specific real－time detection for clenbnterol hydrochloride.

immunosorbent assay；clenbnterol bydrochloride；residual；determination method

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.072

李靖靖（1962－），女，中州大学教授。E－mail：zhongzhoudaxue＠sina.com

2012－02－15