大枣多糖的提取工艺及抗氧化作用研究

亓树艳 王 荔 莫晓燕

（西安交通大学生命科学与技术学院，陕西 西安 710049）

大枣多糖的提取工艺及抗氧化作用研究

亓树艳 王 荔 莫晓燕

（西安交通大学生命科学与技术学院，陕西 西安 710049）

通过设计正交试验优化水浸、超声和微波等方法提取大枣多糖的工艺，在优化条件下，3种方法大枣多糖提取率分别达到11.33%、12.40%、10.98%。体外抗氧化研究结果表明，0.075～0.135mg/mL大枣多糖对·OH 自由基最大清除率分别为48.5%（微波法），47.1%（水浸法），28.2%（超声法）。3种方法获得的大枣多糖提取液均具有体外清除·OH的作用，并呈明显的量效关系，但不同提取方法获得的大枣多糖在抗氧化方面表现出较大的差异，说明提取工艺与其生物学效能密切相关。综合提取工艺、多糖提取率以及抗氧化作用效率，微波法提取大枣多糖效果最佳。

大枣；多糖；提取工艺；抗氧化

大枣是鼠李科枣属植物枣树的果实，其中含有比一般水果高1倍多的糖分，据分析［1］，100g鲜枣含有碳水化合物23.2g，而100g干枣含有碳水化合物50.3～86.9g。大枣中总糖以还原糖为主，主要为葡萄糖和果糖，还含有蔗糖和由葡萄糖与果糖组成的低聚糖、阿拉伯聚糖及半乳糖醛酸聚糖等［2］。研究［3］发现，大枣多糖是由葡萄糖、D－（＋）－木糖和D－（＋）半乳糖组成。它具有提高机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老等多种生物学功能，能有效清除人体内的氧自由基，明显减轻衰老模型小鼠免疫器官的萎缩及脑组织老化，是抗衰老的主要活性成分［4，5］。本试验采用水浸、超声和微波3种方法提取大枣多糖，并对提取工艺进行优化，同时进一步考察不同方法得到的大枣多糖体外抗氧化作用，以期为大枣多糖的工业化生产及其综合利用提供更多思路。

1 材料与方法

1.1 材料

大枣：产地为山东，购于西安农贸市场，－20℃储藏。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要仪器

脂肪提取器：1792，上海华美实验仪器厂；

数控型超声波清洗器：KQ－100DE，昆山市超声仪器有限公司；

机械微波炉：PJ21F－B，美的股份有限公司；

紫外－可见分光光度计：DU－640，美国Beckman公司；

旋转蒸发仪：RE－52A，上海亚荣生化仪器厂；

高速冷冻离心机：J2－MC，美国Beckman公司。

1.2.2 试剂

蒽酮、浓硫酸、葡萄糖、无水乙醇、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、30%双氧水、硫酸亚铁等：均为国产分析纯；

粉末活性炭：国产化学试剂。

1.3 多糖含量测定

1.3.1 绘制标准曲线 称取于80℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0.100g，加水定容至100mL，得到1mg/mL母液，再逐步稀释成浓度为0，0.028，0.048，0.068，0.08mg/mL的标准溶液；分别取1.0mL置于10mL具塞试管中，冰浴5min，加入当日新配制的0.2%蒽酮－硫酸溶液（0.2g蒽酮溶于100mL浓硫酸），沸水浴3min；取出用冷水冷却至室温，静置10min；于620nm以吸光度对葡萄糖浓度绘制标准曲线［6］。

1.3.2 样品测定 取1.0mL大枣多糖提取液按照上述方法测定620nm吸光度，根据标准曲线计算多糖含量。

1.4 大枣多糖提取工艺

1.4.1 工艺流程

大枣烘干→粉碎→称重→脱脂回流→浸提（水浸法、超声法、微波法）→上清液→乙醇沉淀→复溶→去除蛋白质→脱色→粗多糖［7，8］

1.4.2 原料预处理 将市售大枣手工剥皮去核，放入80℃烘箱中烘至水分＜5%，再放入研钵中研成粉末过20目筛，置于干燥器中备用。

1.4.3 脱脂 将枣粉用滤纸包好，放入脂肪提取器浸提管底部；于已称重的小烧瓶中加入150mL无水乙醇；连接脂肪提取器的其他部分，恒温加热回流2h，每小时回流3次。

1.4.4 乙醇沉淀 在大枣提取液中加入4倍体积无水乙醇，使最终乙醇浓度为80%，沉淀多糖［9］。

1.4.5 去除蛋白质 Sevage法脱蛋白，三氯甲烷与正丁醇的比例为4∶1，以相同的体积与被分离液体混合。

1.4.6 活性炭脱色 按照大枣干粉重的5%加入活性炭脱色。

1.4.7 粗多糖含量测定 脱色后的样品经真空冷冻干燥后制得粗多糖，测定多糖含量，按式（1）计算提取率。

式中：

R——大枣多糖提取率，%；

C—— 多糖浓度，g/mL；

V—— 多糖溶液体积，mL；

M—— 干枣粉质量，g。

1.5 提取工艺优化

1.5.1 水浸法提取工艺优化 每组原料为1.5g，采用1.4中的多糖提取工艺，根据前期单因素试验结果选择温度、时间料液比和pH值4个因素按表1进行正交试验。

1.5.2 超声法辅助提取工艺优化 每组原料为1.5g，料液比为1∶20（m∶V），采用1.4中的多糖提取工艺，根据前期单因素试验结果选择温度、时间、pH值和功率4个因素按表2进行正交试验。

在光源的选择上，首先需要考虑激光的波长对系统的影响.如图7所示，分别以常用的中心波长为325 nm、488 nm和632 nm的单色激光作为光源，在matlab中画出归一化光强随腔长变化的曲线.根据式(2)可得，光强的极大值和极小值分别为

表1 水浸法因素水平表Table 1 Factor and level of water soak method

表2 超声法因素水平表Table 2 Factor and level of ultrasonic method

1.5.3 微波法提取工艺优化 每组原料为1.5g，料液比为1∶20（m∶V），采用1.4中的多糖提取工艺，将脱脂回流得到的大枣粉用水浸泡，调节pH后进行微波提取，微波功率用中火。根据前期单因素试验结果选择浸泡时间、pH值和微波时间3个因素按表3进行正交试验。

表3 微波法因素水平表Table 3 Factor and level of microwave method

1.6 大枣多糖体外抗氧化研究

取7支试管，各加入浓度为0.75mmol/L的FeSO4 1mL混匀，向其中5支试管中分别加入0.3mg/mL多糖溶液1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mL，再加入0.1%H2O21.0mL；另2支试管分别作为损伤管（不加多糖提取液）和未损伤管（不加H2O2），用蒸馏水将各管反应体积补至4mL，37℃保温1h，分别测定各管536nm处的吸光值，重复两次，取平均值按式（2）计算大枣多糖的·OH清除率［10］。

式中：

R1——·OH清除率，%；

A2——多糖样品管在536nm下的吸光值；

A1——未损伤管在536nm下的吸光值；

A0——损伤管在536nm下的吸光值。

2 结果与讨论

2.1 多糖含量测定标准曲线

2.2 大枣多糖提取工艺优化结果

2.2.1 水浸法提取工艺优化 浸提温度、浸提时间、料液比和pH 4个因素正交试验结果及极差分析见表4。由表4可知，对大枣多糖提取率的影响因素大小依次为pH＞浸提温度＞料液比＞浸提时间；水浸法提取大枣多糖的最佳条件是A1B3C3D3，在料液比1∶30（m∶V）、pH 8、90℃水浸3h条件下，大枣多糖提取率可达11.33%。

图1 葡萄糖标准曲线Figure 1 The standard curve of glucose

表4 水浸法正交试验结果Table 4 Orthogonal experiment result of water soak method

2.2.2 超声法提取工艺优化 超声温度、超声时间、pH和超声功率4个因素正交试验结果及极差分析见表5。由表5可知，对大枣多糖提取率的影响因素大小顺序为pH＞超声时间＞超声温度＞超声功率；超声法提取大枣多糖的最佳提取条件为E1F1G3H2，经验证实验，在pH 8、功率60W、60℃超声10min条件下，大枣多糖提取率为12.40%。

表5 超声法正交试验结果Table 5 Orthogonal experiment result of ultrasonic method

2.2.3 微波法提取工艺优化 浸泡时间、pH和微波时间3个因素正交试验结果及极差分析见表6。

表6 微波法正交试验结果Table 6 Orthogonal experiment result of microwave method

由表6可知，对大枣多糖提取率的影响因素大小依次为浸泡时间＞微波时间＞pH；微波法提取大枣多糖的最佳条件是I3J3K2，即大枣干粉在pH 8时浸泡80min后微波提取4min，经验证实验，该条件下大枣多糖的提取率为10.98%。

2.3 大枣多糖的抗氧化研究结果

羟基自由基（·OH）是目前所知活性氧中活性最强的一种自由基，它几乎可与细胞内的一切有机化合物反应，并引起系列连锁反应，从而破坏核酸、蛋白质、脂类化合物，进而损伤细胞的结构与功能；它还可以直接损伤各种生物膜，导致多种疾病的发生，从而危及生物体，·OH 清除率是抗氧化作用的重要指标［11，12］。在0.075～0.135mg/mL大枣多糖浓度的范围内，分别对3种不同方法得到的大枣多糖提取液进行清除·OH对比研究。由图2可知，3种方法提取的大枣多糖样品液均具有体外清除·OH的作用，并且呈现明显的量效关系。但不同提取方法获得的大枣多糖对·OH自由基的清除率有较大的差异，最大清除率分别为48.5%（微波法），47.1%（水浸法），28.2%（超声法），微波法提取液和水浸法提取液清除·OH的效果分别为超声法提取液的1.72倍和1.67倍。

图2 不同大枣多糖提取液体外清除·OH的作用Figure 2 The scavenging·OH effects in vitro of different jujube polysaccharide extracts

大枣多糖抗氧化机理与其结构有关，多糖分子具有还原性的半缩醛羟基，能与氧化剂－活性氧发生氧化还原反应。李玲等［13］研究表明大枣多糖对活性氧具有清除作用，且清除效果与多糖用量呈正相关。超声和微波法分别通过空化效应和高能作用破坏细胞壁，影响细胞壁的通透性，加快对胞内多糖的提取率［13］，同时，也会造成多糖成分中侧链和糖苷键结构不同程度的降解断裂，改变多糖分子结构，进而影响它的生物活性。推测其原因可能是不同的提取工艺除了影响活性多糖的提取率外，还会影响多糖的组成、立体结构，进而影响多糖的生物活性［14］；也可能是由于大枣多糖提取液中还存在其它一些抗氧化作用物质（如酚类、黄酮类、色素等）的协同作用有所不同造成的［15－17］。

3 结论

本试验在前期单因素试验的基础上，通过设计正交试验优化了水浸、超声和微波3种方法提取大枣多糖的工艺条件。从大枣多糖提取率看，3种方法均可有效提取大枣多糖，但相对水浸法，超声法和微波法具有省时、高效等特点。此外，通过体外清除羟自由基的检测进一步证实大枣多糖是天然的抗氧化剂，但是3种方法获得的大枣多糖提取液对·OH的清除效果有所不同，提示提取工艺与其生物学效能密切相关。今后有必要对不同方法提取的大枣多糖的分子组成、立体结构以及大枣多糖提取液中含有的其他抗氧化物质进行深入研究。

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Research on extraction condition and anti－oxidation of jujube polysaccharide

QI Shu－yan WANG LiMO Xiao－yan

（School of Life Science and Technology，Xi’an Jiaotong University，Xi’an，Shaanxi710049，China）

The extraction conditions of jujube polysaccharide were optimized by designing orthogonal experiment，and the extraction rates of jujube polysaccharide were 11.33%with water soak method，12.40%with ultrasonic method and 10.98%with microwave method under the optimal conditions.The study on anti－oxidation confirmed that in the concentration range of 0.075mg/mL to 0.135mg/mL the maximum scavenging ratio was 48.5%（microwave），47.1%（water soak）and 28.2% （ultrasonic）respectively.Three kinds of jujube polysaccharide extracts could scavenge·OH in vitro，which showed the relationship to dose－dependence，but the anti－oxidation of jujube polysaccharide extracted with the different extraction method has the significant deviation.It shows that the bioactivities of jujube polysaccharide depend on the extraction condition.In view of these results，the microwave method has the best effect in the extraction of jujube polysaccharide by synthesizing extraction process，extraction rates and anti－oxidation efficiency.

jujube；polysaccharide；extraction condition；anti－oxidation

10.3969 /j.issn.1003－5788.2012.04.032

亓树艳（1984－），女，西安交通大学助理工程师。E－mail：qishuyan＠mail.xjtu.edu.cn

莫晓燕

2012－04－10