ELISA法测定动物产品中氯霉素不确定度的分析

陈俊玉 方成俊 何建顺

（1.东山出入境检验检疫局 福建东山 363401；2.中国检验认证集团厦门有限公司漳州分公司 福建漳州 363000）

酶联免疫吸附法（ELISA）是结合了抗原抗体的特异性反映和酶的高效催化显色反映而形成的一种检测方法，具有特异性好、灵敏度高、操作简便易学、所需设备较少等优点，适合于批量样品的筛选检测，目前广泛用于药物残留快速初筛检测。本文结合ELISA法在动物源性食品中氯霉素残留量检测中的应用，参照国际计量局（BIPM）关于试验不确定度评定方法的建议书和JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》规范，就检测结果不确定度情况进行分析评定。

1 ELISA检测中不确定度来源

检测中不确定度的来源：（1）取样带来的不确定度。（2）被测样品由于提取或分离不完全带来的不确定度。（3）在测量过程中环境条件的影响带来的不确定度。（4）称量和容量仪器的不确定度。（5）标准物质所给定的不确定度以及标准物质在使用过程中产生的变化而引起的不确定度。（6）在测量方法和过程中的某些近似和假设。（7）检测人员读数不准或操作中的随机误差带来的不确定度。

2 材料和方法

2.1 试剂和设备 氯霉素酶联免疫测定试剂盒、酶标仪、电子天平、瓶口移液器、单通道微量移液器。

2.2 检测过程（按照SN/T1604-2005）

3 ELISA法检测动物源性食品中氯霉素残留量中的不确定度评定

3.1 称样的相对标准不确定度Uc（称样）rel称取样品3.0 g，为计算方便，设实际称重为3.00 g。称量天平称量不确定度主要为称量变动性，根据电子天平技术参数，其变动性标准偏差为0.01 g，按照均匀分布换算成标准偏差为0.01/31/2＝0.0058，则称样的相对不确定度为：U c（称样）rel＝0.0058/3.00＝0.00193。

3.2 样品稀释液的相对标准不确定度Uc（样品）rel 3.2.1 乙酸乙酯纯度的不确定度Uc（乙酸乙酯）rel乙酸乙酯纯度为（99.5±0.5）%，按均匀分布换算成标准偏差，即相对标准不确定度Uc（乙酸乙酯）rel＝0.005/31/2＝0.00289。

3.2.2 移取乙酸乙酯的相对标准不确定度Uc（提取液）rel用瓶口移液器取1次6 mL乙酸乙酯，根据瓶口移液器的检定结果为0.003 mL，按照平均分布换算成标准偏差，即相对标准不确定度Uc（提取液）rel＝0.003/31/2＝0.00173。

3.2.3 稀释样品带来的不确定度Uc（稀释）rel用单通道微量移液器取1.0 mL稀释缓冲液，根据单通道微量移液器的技术指标和检定结果，其相对标准不确定度为 0.0024，即 Uc（稀释）rel＝0.00240。

将以上三个项目合成，则Uc（样品）rel＝（0.002892＋0.001732＋0.002402）1/2＝0.00414。

3.3 ELISA试验操作过程的不确定度Uc（试验）rel

3.3.1 微量移液器加样Uc（加样）rel用单通道微量移液器加样50 uL（整个试验每孔均只加样1次）所带来的相对不确定度为Uc（加样）rel＝0.00240。

3.3.2 反应温度带来的相对标准不确定度Uc（温度）rel使用低温生化培养箱来获得ELISA的底物温度25℃，根据低温生化培养箱技术指标，温度波动范围为±1.0℃，按照均匀分布换算成标准偏差为1.0/31/2＝0.58 ℃，则 Uc（温度）rel＝0.58/25＝0.0232。

3.3.3 反应时间的相对标准不确定度Uc（时间）rel在ELISA试验过程中，反应时间也可能产生不确定度。根据日常试验经验，取反应时间变动范围为±30 s。根据均匀分布换算成标准偏差为30/31/2＝17.3 s，则Uc（时间）rel＝［（17.3/（60×60））2+（17.3/（30×60））2］1/2＝0.0108。

将上述三项相对标准不确定度合成，得到Uc（试验）rel＝（0.002402＋0.02322＋0.01082）1/2＝0.0257。

3.4 酶标仪读数相对不确定度Uc（酶标仪）rel从Labsystems-MK3酶标仪在1～1.5吸光度单位内的不确定度为 0.5%，则 Uc（酶标仪）rel＝0.005。

3.5 数据处理带来的相对标准不确定度Uc（计算）rel因在检测结果数据处理中，需根据标准曲线对样品的检测结果进行计算，在这过程中，所用的标准曲线是被假设成真实的标准曲线，也就带来了数据处理方面的不确定度，可用标准曲线线性相关系数来反映，根据检测经验数据，r＝0.990，则 Uc（计算）rel＝0.010。

3.6 合成不确定度Uc（合成）rel将3.1-3.5各项分相对标准不确定度进行合成，则得到ELISA法检测动物源性食品中氯霉素含量的合成不确定度：

3.7 展伸不确定度（总不确定度） 取包含因子K＝3（置信水平＝0.997），则：

总不确定度 UC＝K×Uc（合成）rel＝3×2.84%＝8.52%。

4 结论

从上述不确定度分析可以看出，按照SN/T1604-2005用ELISA法对动物源性食品中氯霉素含量进行检测，在置信水平P为0.997时，其相对不确定度为8.52%，与其他分析方法的相对不确定度比较而言较大，主要与ELISA法本身特性有关：（1）ELISA法结合了抗原抗体的免疫反映和酶的高效催化反应，检测限较低，特异性好，方便使用于检测痕量物质，而痕量物质的检测必然伴随较大不确定度。（2）ELISA法检测需使用多种生化、免疫学及分子生物学试剂，如抗原、抗体、底物TMB等，这些试剂本身所具有的不稳定性对检测结果也相应带来较大的直接影响。（3）用ELISA法检测时还受到反应温度、反应时间、洗涤效果、人员操作等其他因素的影响，这也是不确定度的重要来源。

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