不同产地麦冬遗传多样性的SRAP分析

马秀杰，王冠明，韩烈保，3

（1.北京林业大学草坪研究所暨森林培育与保护省部共建实验室，北京100083；2.鸿铭控股有限公司，北京100020；3.长江大学园艺园林学院，湖北 荆州434025）

“麦冬”指以麦冬为名的百合科沿阶草族（Ophiopogoneae）沿阶草属（Ophiopogon）和山麦冬属（Liriope）植物，在我国广泛分布，除华北、东北和西北外，其他各省（区、市）均有分布。麦冬具有润肺清津、养阴清热的功能，块根可入药。一些麦冬品种具有四季常绿、耐践踏、耗水少、易繁殖等特点，被广泛应用于园林绿化。麦冬的抗逆性、生态效益、经济效益优于其他冷季型和暖季型草坪草［1］。目前全国以麦冬为名的沿阶草属有18个种（变种），山麦冬属植物共有8个种（变种）［2］。麦冬类植物的分类混乱，山麦冬属和沿阶草属的划分一直存在争议［3］，如湖北麦冬（L.spicata）与山麦冬（L.spicata）未开花时形态较为相似，难以鉴别［4］。因而，对我国不同产地的麦冬进行亲缘关系和遗传多样性分析具有重要意义。

近年来，我国有关麦冬遗传多样性和分子标记的研究已逐渐展开。吴弢等［5］采用RAPD技术对4种山麦冬属植物进行了分类学研究，李风涛和雷公藤［6］利用RAPD标记对福建省内不同产地的短葶山麦冬（L.muscari）进行了种源研究。黄玉吉等［7］测定了7个不同产地麦冬（O.japonious）和山麦冬的rDNA-ITS序列。但上述研究选用的样品相对较少，分布狭窄。鉴于此，本研究采用SRAP分子标记技术对来自全国不同产地的48份麦冬材料进行遗传多样性研究，分析麦冬种质资源的遗传多样性，为麦冬的鉴定、种质资源筛选提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 对采自全国不同地区的98份麦冬进行分株扩繁后，选取48份材料进行测试，其中野生种19个，栽培种29个（表1），野生种用 W标识，栽培种用C标识。

1.2 DNA的提取 取新鲜麦冬叶片，液氮研磨后采用改良的CTAB法分别提取其基因组DNA［8］。

1.3 引物筛选与PCR扩增 SRAP所用引物及序列参照Li和Quiros发表的文献［9］，引物由上海生工生物有限公司合成（表2）。首先选取4个具有代表性的材料（杭麦冬、川麦冬、阔叶山麦冬、山麦冬）对64种引物组合进行筛选，获得多态性好，且条带清晰的11种引物进行扩增。扩增反应总体系为25μL：模板DNA 50ng，TransTaq-T酶1.25U，10× TransTaq-T buffer 2.5 μL，dNTPs 0.2 mmol·L-1，上、下游引物各0.2μmol·L-1，加灭菌水至25μL。SRAP-PCR采用复性变温法：94℃预变性5min；94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸10min，4℃条件下保存。

表1 供试材料及来源Table 1 Name and source of materials in this study

表2 本试验所用引物组合Table 2 Primer sequences used in this study

1.4 数据处理 对清晰、可重复的DNA条带进行统计，在相同迁移位置上，将稳定出现的有条带的记为1，无带的记为0，获得0和1组成的原始矩阵。利用表型矩阵，统计SRAP扩增产物的条带总数和多态性条带数量。按照Nei-Li［10］相似系数的方法计算。

式中，X1、X2分别为成对比较的2个品种的扩增带数，X1，2为共有带数。

采用（Nei-Li）遗传相似系数、UPGMA 法［11］进行聚类分析。数据处理采用DPSv 7.05软件。

2 结果与分析

2.1 不同产地麦冬SRAP扩增产物的多态性分析 从64对引物组合中筛选出多态性好且条带丰富的11对引物组合（表3），对48份麦冬种质进行PCR扩增，共产生621条清晰条带，平均每对引物组合产生56.45条多态性条带。me3＋em7引物组合扩增最多，为88条，me7＋em3引物组合扩增出65条（图1），me7＋em6扩增最少，为36条。多态性总条带数目为621条，平均多态性比率（PPB）达到100%。说明供试麦冬具有很高的遗传多样性。

表3 11对引物组合的SRAP扩增结果Table 3 Amplified results of SRAP with 11pairs of primers

图1 引物组合me7＋em3对48份麦冬的的扩增结果Fig.1 SRAP amplification profiles of 48Lilyturfs with primer combination me7＋em3

2.2 遗传距离与遗传相似性分析 48份供试麦冬材料的相似系数GS值为0.058 4～0.936 7，平均为0.497 5，变幅为0.878 3，遗传距离GD为0.066 3～0.941 6，平均为0.504，变幅为0.875 3。来自江苏沭阳的7号日本矮生沿阶草与来自广西南宁的9号麦冬遗传距离最小，为0.066 3，说明两者具有较近的亲缘关系。来自云南西双版纳的44号高脚沿阶草与来自四川三台的1号川麦冬遗传距离最大，为0.941 6，说明两者亲缘关系较远。分析结果表明，供试材料之间遗传相似度低，差异明显。

2.3 不同产地麦冬种质聚类分析 在遗传距离0.81处可将供试材料分成六大类（图2）。第Ⅰ类共13份材料，又可分为2个亚类。第1亚类供包括10个材料，主要为产地不同的麦冬，第2亚类有3个材料，全部为沿阶草。第Ⅱ类19份材料，分属麦冬（O.japonicus）、山麦冬（L.spicata）、阔叶山麦冬（L.platyphylla）、短葶山麦冬（L.muscari）、禾叶山麦冬（L.graminifolia）5个种。其中3、5、8号为麦冬，与其他材料遗传距离较远，优先聚为一个亚类，27、28、29号阔叶山麦冬、30号金边阔叶麦冬和31号短葶山麦冬麦冬5份材料聚为一个亚类。第Ⅲ类共12份材料，除40号外，其余皆为沿阶草，云南材料占该类群的75%。第Ⅳ类仅一份材料，形态学上鉴定为矮小沿阶草（O.bodinierivar.pygmaeus），23、24和25号聚为一类。第Ⅴ类为细叶银边沿阶草（O.intermediuscv.Argenteo-marginatus）。第Ⅵ类包括两个沿阶草材料。

图2 48份麦冬种质遗传距离分析聚类图Fig.2 Dendrogram of 48Lilyturf accessions based on SRAP

3 讨论

SRAP分子标记是由Li和Qurios［9］于2001年提出的一种新型的基于PCR的分子标记方法。SRAP技术具有简便、快速，不需预知物种的序列信息等特点，在植物遗传多样性分析［12］和种质鉴定［13］方面得到了广泛应用。近年来，SRAP开始应用于结缕草（Zoysiajaponica）［14］、野牛草（Buchloedactyloides）［15］和狗牙根（Cynodondactylon）［16］等草坪草和牧草的遗传多样性分析。本试验筛选出11对条带清晰、可重复的引物，共扩增出621条谱带，平均多态性比率为100%。SRAP分子标记中，种内平均多态比率达90%以上的报道相对较少，多见于种间。刘晓宏［17］对31份漆树（Toxicodendron vernicifluum）种质进行SRAP分析，11对引物组合扩增条带平均多态性比率为98.04%。刘建丰［18］对29份野生烟草（Nicotianatabacum）种质进行SRAP-PCR扩增，18对引物组合扩增多态性比率达到100%。陶爱芬等［19］用23对引物组合对96份黄麻（Corchoruscapsularis）种质资源进行SRAPPCR扩增，多态性比率也为100%。

本研究选用的麦冬类材料分属麦冬属和沿阶草属，分化明显、多样性突出，表型丰富。扩增结果表明，使用SRAP分子标记技术可以有效地对麦冬进行遗传多样性分析。余伯阳和徐国钧［2］观察了湖北麦冬与山麦冬两种植物的块根和叶的组织形态，发现两者之间无明显差异，因此认为湖北麦冬的分类学位置有待进一步研究。吴弢等［5］对4种麦冬进行RAPD遗传多样性分析后认为，湖北麦冬与山麦冬的相对遗传距离大于山麦冬与阔叶山麦冬的相对遗传距离，湖北麦冬和山麦冬应该为两个种。本研究采用SRAP分子技术对48种麦冬的遗传多样性分析显示，14号湖北麦冬与来自不同产区的19、20、21和22号山麦冬可聚为一大类，但是相对遗传距离大于同类中来自不同产区的26、27、28、29和30号麦冬，进一步支持了吴弢等［5］的观点。31号短葶山麦冬与26、27、28、29和30号阔叶山麦冬可聚为一类，且遗传距离非常小，这与徐炳声和李林初［20］的阔叶山麦冬和短葶山麦冬无明显界限，阔叶山麦冬为短葶山麦冬变种的观点一致。

Wilson等［21］认为种质的地理分布与分子标记间存在相关性，在苜蓿（Medicagosativa）22、狗牙根［23］、白三叶（Trifoliumrepens）［24］等草坪草和牧草上的遗传分析也证实了来自相似地理环境的种质可以优先聚为一类。本研究通过对产地不同的麦冬进行SRAP统计分析和聚类分析，发现供试材料也呈现一定的地域分布规律。第Ⅰ类群来自四川的1和2号以及来自浙江的4和6号分别聚在一起，可能与它们起源以及分布相似性有关。第Ⅱ类群中，来自北京的3、15和16号生态环境相似，也可以聚在一起。第Ⅲ类群中，来自云南的32、34、35、36、38、41、42、43、46和47号沿阶草材料可以聚为一类，这可能由于云南特有的海拔高度、土壤气候及降雨对沿阶草的自然选择造成的影响，使得该地区材料基因型趋近一致。来自浙江慈溪的5号栽培种麦冬及6号野生种麦冬未能聚在一起，这可能是由人为选择导致的。

［1］张进友.优良的草坪地被植物沿阶草［J］.草业科学，2003，22（2）：69-70.

［2］余伯阳，徐国钧.麦冬类中药的药源调查和商品鉴定［J］.中国药科大学学报，1991，22（3）：150-153.

［3］Hume H H.The Ophiopogon-Liriope complex［J］.Baileya，1961，9（46）：134-158.

［4］刘霞，曹秀荣，陈科力，等.湖北麦冬的研究进展［J］.医药导报，2008，27（10）：1231-1234.

［5］吴弢，周开亚，王义权，等.RAPD在山麦冬属四种植物分类中的应用［J］.中草药，1998，29（1）：37-40.

［6］李风涛，雷公藤.基于道地药材短葶山麦冬RAPD种源鉴别研究［D］.福州：福建农林大学，2009：32-34.

［7］黄玉吉，陈菁瑛，苏海兰，等.不同产区麦冬、山麦冬rDNA-ITS序列分析［J］.福建农业学报，2009，24（6）：508-512.

［8］王冠明，韩烈保，马秀杰，等.麦冬基因组DNA提取方法研究［J］.生物技术通报，2010（6）：100-106.

［9］Li G，Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging inBrassica［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103：455-461.

［10］Nei M，Li W H.Mathematical model for studying genetic variation in term of restriction endonucleases［J］.Proceeding of the national Academy Scineces，1979，76：5269-5273.

［11］Rohlf F J.NTSYS-pc.Nuberical Taxonomy and Multivariate Analysis System （Version 2.0）［M］.New York：Exeter Software，2001：16-29.

［12］Ferriol M，Pico B，Nuez F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbitapepo using SRAP and AFLP markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，107：271-282.

［13］张建成，王传堂，焦坤，等.SRAP标记技术在花生种子纯度鉴定中的应用［J］.中国农学通报，2005，21（12）：35-39.

［14］郭海林，郑轶琦，陈宣.结缕草属植物种间关系和遗传多样性的SRAP标记分析［J］.草业学报，2009，18（5）：201-210.

［15］周莹洁，王显国，张新全.野牛草种质基于SRAP标记的遗传多样性研究［J］.草业科学，2011，28（11）：1930-1935.

［16］王志勇，袁学军，刘建秀.狗牙根SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选［J］.草业学报，2008，17（3）：79-85.

［17］刘晓宏.漆树种质资源遗传多样性及亲缘关系的SRAP分析［D］.扬州：扬州大学，2009：27-41.

［18］刘建丰.烟草核心种质DNA遗传多样性研究［D］.北京：中国农业科学院，2007：34-39.

［19］陶爱芬，祁建民，粟建光，等.SRAP和ISSR及两种方法结合在分析黄麻属起源与演化上的比较［J］.作物学报，2011，37（12）：2277-2284.

［20］徐炳声，李林初.短葶山麦冬种群分类问题的探讨［J］.植物分类学报，1980，19（4）：456-461.

［21］Wilson B L，Kitzmilier J，Rolle W，etal.Isozyme variation and its environmental correlates inElymus glaucusfrom the California Floristic Province［J］.Canadian Journal of Botany，2001，79：139-153.

［22］何庆元，吴苹，张晓红，等.不同秋眠性苜蓿SRAP体系优化及遗传多样性分析［J］.草业学报，2011，20（2）：201-209.

［23］凌瑶，张新全，齐晓芳，等.西南五省区及非洲野生狗牙根种质基于SRAP标记遗传多样性分析［J］.草业学报，2010，19（2）：196-203.

［24］张婧源，彭燕，罗燕，等.不同产地白三叶种质遗传多样性的SRAP分析［J］.草业学报，2010，19（5）：130-138.