白羊草茎段愈伤组织诱导和植株再生

于 娜，董宽虎

（1.山西省林业职业技术学院园林系，山西太原030009；2.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

白羊草（Bothriochloa ischaemum）是禾本科孔颖草属多年生草本植物，是优良的牧草和水土保持植物，具有固土保水，生活力强，高产耐牧、耐践踏，适口性强等优点，是饲用价值较高的放牧型禾草之一，广泛分布于我国暖温带落叶阔叶林地带，是控制水土流失和维持丘陵山地的原生态平衡的重要草种[1-2]。目前，关于白羊草组培再生体系的研究较少，仅20 世纪90 年代永杰等[3-4]进行过探讨。

笔者在连续以白羊草成熟胚、真叶为外植体材料，成功建立了植株再生体系的基础上[5-6]，以拔节期茎切段作为外植体，通过对其组织培养中愈伤诱导和植株再生情况进行研究，以期筛选出其在组织培养过程中较为合适的激素组合，为进一步开展白羊草的组织培养及分子生物学研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料来源

供试白羊草种子于2006 年10 月采自山西省太谷县凤山。该区海拔1 100 m，植被为喜暖灌草丛类草地，建群种为白羊草（Bothriochloa ischaemum），其千粒质量为0.697 5 g[7]。

待白羊草成熟胚培养出的1 月龄无菌幼苗长至拔节期时，截取0.5～1.0 cm 的带节小段接种于供试的不同培养基上。

1.2 培养基配制、灭菌及培养室条件

以MSB（MS 无机盐＋B5 有机成分）培养基加3%蔗糖、5%琼脂粉制备基础培养基，pH 值调至5.8；在121 ℃条件下灭菌20 min。诱导愈伤培养条件：黑暗培养，室温为（25±2）℃。分化培养条件：光照16 h/d，室温为（25±2）℃，光照强度为2 000～3 000 lx。

1.3 诱导培养基

1.3.1 诱导愈伤组织 共设5 个诱导培养基，在基础培养基上分别附加2，4-D 2.0 mg/L 和不同质量浓度的6-BA（0（G1），0.2（G2），0.5（G3），1.0（G4），1.5（G5）mg/L）。每个处理接种茎段30 个，重复3 次。将诱导出的愈伤组织再接种至继代培养基MSB＋2，4-D 1.0 mg/L 上进行培养。

1.3.2 诱导愈伤组织分化 将继代培养后的愈伤组织转移到附加有不同质量浓度6-BA 和NAA 的分化培养基中进行培养。共设7 个分化培养基，即J1.6-BA 0.1 mg/L＋NAA 0.03 mg/L；J2. 6-BA 0.1 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；J3. 6-BA 0.1 mg/L＋NAA 0.07 mg/L；J4. 6-BA 0.03 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；J5. 6-BA 0.04 mg/L ＋NAA 0.05 mg/L；J6.6-BA 0.06 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；J7.6-BA 0.07 mg/L＋NAA 0.05 mg/L。每个处理接种愈伤20 个，重复3 次。

1.4 数据处理

1.4.1 定性指标 为衡量愈伤组织质量，根据其形态特征，把愈伤组织分为5 个等级[8]。1 级：愈伤组织呈乳白色、淡黄色，新鲜，质地中等，易碎，生长旺盛；2 级：愈伤组织呈乳白色，质地较松散，生长较快；3 级：愈伤组织呈青白色，透明水浸状，生长缓慢；4 级：愈伤组织呈白色，顶部生有气生根，生长迟缓；5 级：愈伤组织呈青白色，结构致密，质地坚硬，生长缓慢。

1.4.2 定量指标 对出芽率、愈伤组织诱导率、分化率进行了统计，每处理重复3 次。出芽率＝出芽数/接种外植体数×100%；出愈率＝产生愈伤组织块数/接种种子数×100%；分化率＝产生绿色原基的愈伤组织数/接种愈伤数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同诱导培养基对愈伤组织诱导的影响

试验观察表明，将茎段接种在诱导愈伤培养基（图1-A）7 d 左右，茎节处开始膨大，15 d 左右开始产生愈伤组织（图1-B），接种在不同诱导培养基上的茎段开始出愈时间差异不大，G1 处理出愈最早，而且量也多，出愈率达到35.83%（图1-C，表1），G5 处理的出愈率也达到35.29%（表1），G2～G5 处理上的愈伤量随着6-BA 质量浓度的提高而增加，但质量较差，30 d 后呈现褐色，颗粒致密，生活力较小。而G1 处理愈伤大多呈白色，愈伤团粒状，致密，有生活力。因此，G1 处理对愈伤组织诱导最好。

表1 不同处理对白羊草茎段诱导愈伤的影响

2.2 白羊草愈伤组织的继代

诱导出来的愈伤组织在诱导培养基上培养30 d 后，愈伤已明显增长变大。但是由于出愈伤的部位一般在茎节处，且连接较紧密（图1-C），所以，需要先在超净工作台上，无菌条件下用消毒过的刀镊剥离愈伤组织，然后再继代到2，4-D质量浓度为1.0 mg/L 的继代培养基上，实现非胚性愈伤向胚性愈伤转化，使致密或疏松的颗粒中胚性愈伤组织发生率提高。

本试验中，白羊草成熟胚的胚性愈伤组织只能在形成松软的非胚性愈伤之后，通过降低培养基中2，4-D 的质量浓度，使致密或疏松的颗粒中胚性愈伤组织发生率提高（图1-D）。

2.3 白羊草愈伤组织的分化

无菌苗茎段诱导出的愈伤继代7 d 后接种到分化培养基上。每5 d 观察1 次，第8 天可以观察到愈伤组织有绿色芽点出现，芽点虽多，但20 d 后才可以观察到有少量丛生芽产生，随着分化愈伤增长至2～3 cm，多数芽点变褐，一般最后1 个愈伤只分化1 个不定芽。1 个月后可长至20 cm 左右，同时根系发达（图1-E），此时即可炼苗后移栽，植株生长良好（图1-F）。只有少数分化植株未长出根，将未分化出根的小苗转入无任何激素的培养基中即可生根。

由表2 可知，J1～J3 分化培养基中6-BA 保持在0.1 mg/L 时，NAA 在0.03，0.05，0.07 mg/L变化时愈伤分化率不显著（P＜0.05），以J2 分化率为最高。当降低6-BA 质量浓度，保持NAA 质量浓度为0.05 mg/L 时，J3～J7 处理的分化率差异显著，尤以6-BA 在0.07 mg/L 时分化率为最高，达到82.62%；其次为6-BA 0.06 mg/L，分化率为79.37%；但当6-BA 质量浓度降低至0.03，0.04 mg/L 时，分化率急剧下降，说明6-BA 对分化率有显著影响（P＜0.05）。

表2 不同分化培养基对茎段愈伤分化的影响

3 讨论

愈伤在1 个月后增大至1.5～2.0 cm，此时不定芽陆续出现，1 个愈伤块上通常有10～20 个绿色芽点，少部分愈伤分化前先出现紫色的小点，后逐渐才转为绿色。产生部位一般在茎节处，愈伤组织包裹着茎节，一般为结构松软、白色的非胚性愈伤组织，少数愈伤组织在茎段切口处产生。

Griffin 等[9-11]对早熟禾、大麦、狗牙根、高羊茅的研究结果表明，在诱导培养基中添加较低质量浓度的6-BA，可促进胚性愈伤组织的形成，提高愈伤质量，增加其再生能力。在培养基中加入细胞分裂素的目的，主要是为促进细胞分裂和不定芽的形成，打破顶端优势，有利于形成丛生芽并增殖[12]。长期以来，人们广泛地把生长素/细胞分裂素的值运用于组培中，二者的比例决定着芽和根的分化。一般来说，当生长素/细胞分裂素的值高时，有利于长根，低时有利于长芽，中间值有利于愈伤组织的诱导和分化[13]。本试验中，诱导培养基上的茎段不仅有愈伤诱导，还有侧芽产生，随着6-BA 质量浓度的提高，出芽率增加，但增长幅度不大。本试验没有筛选出侧芽的增殖和生根诱导的培养基组合。

植物体内同时存在数种植物激素，它们之间可相互促进增效，也可相互拮抗抵消[14]。在植物生长发育过程中，任何一种生理过程往往不是培养基中某一激素的单独作用，而是培养基中多种激素相互作用的结果[15]。

大量研究表明，诱导植株再生能否成功，受内因和外因的共同影响，内因是指植物组织的来源、年龄、生理状态和发育时期等，而外因则是指培养条件和预处理等。同一材料的不同外植体在相同的培养条件下培养时，其再生能力也存在差异。通过试验发现，白羊草成熟种子与真叶、茎段在愈伤组织及不定芽的诱导上差异显著，成熟种子更利于白羊草高效植株再生体系的建立。同时还发现，外植体的接种方法，如接种密度、分割大小等均会影响白羊草植株再生，如用无菌苗茎节片断为外植体的愈伤诱导率不高，一个原因有可能是这部分组织本身的分生能力较差；另一个原因可能是试验过程中没有准确地切取所需部位，造成出愈率低。

前人研究表明，在相同的分化培养基上，成熟种子分化率很高，说明相同种类的激素配比对同一植物的不同器官组织培养有不同的效果，也就是同一材料的不同外植体在相同的培养条件下，其再生能力也存在差异。

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