EGCG 改善高浓度TNF－α对人皮肤创伤愈合中成纤维细胞的抑制作用

余红梅， 胡宏鸯， 吴 霞， 方海云△

(浙江大学医学院附属邵逸夫医院1 普外科，2 皮肤科，浙江 杭州310006)

皮肤创口愈合是一个复杂的生物学过程。成纤维细胞是创口愈合的主要修复细胞，它在创口修复过程中的增殖、迁移以及胶原的合成，直接影响其愈合［1］。创口局部的炎症反应有助于创口愈合过程的启动和完成，但过度的炎症反应可导致伤口的迁延不愈［2］，表现为愈合迟缓性皮肤伤口(delayed wound healing，DHW)。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF－α)是由多种细胞分泌的炎症因子，对早期炎症细胞的迁移和聚集等起到重要作用。但是目前它对于皮肤成纤维细胞的作用尚存争议，认为低浓度的TNF－α 可以促进成纤维细胞的增生［3］，而另有研究认为局部TNF－α显著增高可抑制皮肤创口的愈合［4－5］。

表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocathechin－3 gallate，EGCG)是一种茶多酚的提取物单体，它具有显著抗炎和抗氧化作用，可以抑制皮肤成纤维细胞MMP 的合成和表达，延缓细胞老化，促进伤口愈合［6－7］。但其对创口愈合中成纤维细胞的影响国内外研究较少。本实验旨在通过观察高浓度TNF－α 对人皮肤成纤维细胞增殖、迁移和胶原蛋白合成的作用以及EGCG 预处理的影响，探讨EGCG 对过度炎症反应延迟的创口愈合是否有改善作用。

材 料 和 方 法

1 主要试剂和仪器

人TNF－α(PeproTech);EGCG(Sigma);低糖DMEM 培养基(Gibco);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所);0.25%胰酶(Gibco);0.25%dispaseII 酶(Gibco);山羊抗Ⅰ型胶原蛋白抗体(Santa Cruz);HRP 标记的山羊Ⅱ抗(杭州联科生物公司);蛋白定量试剂盒(Bio－Rad)。Cell Counting Kit－8(CCK－8)试剂盒(Dojindo)。

2 细胞培养与传代

取健康男性青少年包皮环切术切除的包皮，剪去皮下组织，成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的皮片，碘伏浸泡5 min，PBS漂洗3 次。加入0.25% dispaseⅡ于4 ℃消化16 ～20 h，分离表、真皮，然后用0.25%胰酶37 ℃反复消化，以含10%胎牛血清的DMEM 培养液中和。200 目细胞筛过滤，1 000 r/min离心，接种至25 cm 细胞培养瓶，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱。待细胞贴壁生长到80%融合，用0.25%胰酶消化传代。取4 ～8 代细胞进一步实验。

3 实验分组

调整细胞密度为2 ×108/L，接种于6 孔板，待90%融和，予以干预分组。(1)正常对照组:未予以任何干预，含10%胎牛血清的低糖DMEM 培养液培养;(2)TNF－α 干预组:在培养液中加入人TNF－α 至终浓度为10 μg/L，作用24 h;(3)TNF－α+EGCG 干预组:EGCG 预处理1 h 后，加入TNF－α 10 μg/L，作用24 h。

4 细胞增殖实验

细胞接种于96 孔板，每孔5 ×103个。待细胞贴壁后予以相应的干预，24 h 后向每孔加入10 μL CCK－8 溶液，继续在培养箱孵育4 h 后，用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度值。

5 细胞划痕愈合实验

细胞接种于6 孔板至90%融合并予以相应干预后，用20 μL 枪头在单层细胞上垂直划出一细痕，制作出细胞伤口模型。划痕后用PBS 清洗2 次，换用含1%胎牛血清的低糖DMEM 培养液以排除细胞增殖的影响，继续培养24 h 和48 h后倒置显微镜观察细胞划痕创面愈合程度。细胞平行迁移率(%)=(1－剩余划痕区面积/原划痕区面积)×100%。实验重复3 次。

6 Western blotting 检测

将6 孔板上的细胞用PBS 清洗3 次后，加入细胞裂解液冰上裂解30 min，离心后取上清以Lowery 法蛋白定量。按每孔50 μg 蛋白上样于10% SDS－聚丙烯酰胺凝胶，电泳后转移至PVDF 膜，室温下封闭1 h 与Ⅰ抗结合(1∶1 000 稀释)，4 ℃过夜，TBST 洗膜后再与Ⅱ抗室温结合1 h，滴加ECL 液，用Image Quant LAS－4000(Fujifilm)曝光仪曝光。条带灰度分析采用Image Multi－Gauge 软件(Fujifilm)。

7 统计学处理

结 果

1 TNF－α 抑制细胞增殖以及EGCG 干预的作用

如图1 所示，TNF－α 抑制成纤维细胞的增殖，较对照组差异显著，而EGCG 预处理后显著改善TNF－α 的增殖抑制作用，并呈浓度依赖性，在40 μmol/L 时即达到最大效应。

Figure 1. The A value detected by CCK－8 assay. The A value decreased in the cells treatment with TNF－α，and it was improved by EGCG pre－treatment in a dose－dependent manner. ± s. n =5. * P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs EGCG(40 μmol/L)+ TNF－α.图1 各干预组对成纤维细胞增殖的影响

2 TNF－α 延迟细胞划痕愈合以及EGCG 干预的作用

如图2 所示，成纤维细胞从细胞划痕边缘向中心移动。TNF－α 10 μg/L 作用24 h 后，成纤维细胞的迁移率即出现显著抑制(P ＜0.05)，而EGCG(40 μmol/L)干预后则在24 h即能改善TNF－α 的延迟愈合作用(P ＜0.05);48 h 后，对照组与EGCG 干预组基本愈合(迁移率分别为91.50% 和88.83%)，而TNF－α 组愈合仍显著延迟，迁移率为46.01%(P ＜0.05)。

3 TNF－α 抑制I 型胶原蛋白表达以及EGCG 干预的作用

如图3 所示，TNF－α 组Ⅰ型胶原蛋白的表达水平明显低于对照组，而EGCG(40 μmol/L)干预后显著改善collagen I的表达。

讨 论

伤口愈合是一个非常复杂的生物学过程。其延迟愈合容易引起局部感染，甚至发展为慢性非愈合伤口。成纤维细胞在皮肤创口愈合中起到重要作用，它经过增殖、迁移，分泌胶原蛋白、细胞外基质和大量的生长因子，与新生血管等构成肉芽组织，填补创面，帮助表皮细胞覆盖。

Figure 2. The migration of dermal fibroblasts measured by wound healing assay. A:cell migration at 0 h，24 h and 48 h from the scrape margin;B:quantitative analysis of the migration rates. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs control.图2 各干预组对成纤维细胞迁移的影响

Figure 3. The expression of collagen I in each group measured by Western blotting. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs control.图3 各干预组对成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

在创口修复的早期，局部的炎症反应有助于清除细菌和细胞碎片，募集单核/巨噬细胞，分泌多种细胞因子如IL－1β、TGF－β 等，刺激成纤维细胞进入创面［7］。Ezoe 等［3］曾指出低浓度的TNF－α可以促进整合素α2β1的表达。整合素α2β1作为胶原和层黏连蛋白的受体，其表达增加有助于创伤愈合中成纤维细胞的黏附［8］。但是延迟愈合的伤口也常伴随炎症细胞的过度浸润和胶原沉积的减少。过度的炎症也容易引起基质脆性增加和疤痕收缩异常［4，9］。Lai 等［5］发现局部的TNF－α 浓度增加可以延迟伤口愈合，也有人报道TNF－α 能拮抗TGF－β1诱导的成肌纤维细胞的分化和平滑肌α－肌动蛋白的表达［4，10］，而这两者在伤口愈合后期起关键作用。针对目前的争议，本实验采用了10 μg/L 的TNF－α作用于体外培养的皮肤成纤维细胞。我们发现高浓度的TNF－α 显著抑制成纤维细胞的增殖。而且在细胞划痕愈合实验中，TNF－α 组划痕24 h 后即出现明显差异，48 h 后仍未完全愈合，与对照组相比细胞迁移能力显著受到抑制。Western blotting 也提示TNF－α 组的I 型胶原蛋白明显下降，这也将不利于皮肤伤口的愈合。实验结果说明高浓度的TNF－α对成纤维细胞的功能学表现有明显抑制作用，从而影响皮肤创口的愈合。

近年来，茶多酚的研究越来越受到人们的重视。EGCG属于茶多酚中提取的单体，由于其显著的抗炎抗氧化作用，在诸多疾病如心血管疾病［11］、肿瘤［12］、炎症性肠病［13］等中有广泛应用。有研究发现［14］，EGCG 能阻断由紫外线B 照射诱发的皮肤白细胞浸润，减少氧自由基的生成，并调控角质细胞分化。动物实验［7］也提示EGCG 可以加快小鼠皮肤的创口愈合，抑制小鼠伤口附近IL－1β 和MMP－1 的过度分泌。然而EGCG 对于伤口愈合的细胞学机制在国内外未见明确报道。由于皮肤成纤维细胞在伤口愈合中起关键作用，本研究将高浓度TNF－α 干预的成纤维细胞用EGCG 预处理1h。我们发现EGCG 处理后，TNF－α 对成纤维细胞的功能学抑制明显得到改善，增殖和迁移能力显著恢复，被抑制的胶原蛋白表达也有增加，表明EGCG 可以抑制皮肤创口中过度的炎症反应，恢复正常的成纤维细胞功能，从而促进伤口愈合。

本实验通过观察EGCG 和高浓度TNF－α 对成纤维细胞的功能学影响，阐述了高浓度TNF－α 对皮肤成纤维细胞增殖、迁移和胶原蛋白表达的抑制作用以及EGCG 的保护作用，从细胞学机制说明了过度炎症反应延迟皮肤创口愈合，并提出了可能的治疗手段。

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