牛结核病综合防控措施

熊学凯 陈颖钰 郭爱珍 *

1.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；2.华中农业大学动物科技学院，武汉 430070；3.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070

牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的人畜共患的一种慢性消耗性传染病，OIE将其列为需上报疾病，在我国属于二类动物疫病。该病以组织器官的结核结节性肉芽肿和干酪样、钙化的坏死病灶为特征，导致病牛渐进性消瘦、咳嗽、生产能力下降、衰竭直至死亡。牛结核病在世界各国均有发生，在我国仍然是最常见的多发性疾病之一。目前，全球范围内每年约有5000万头牛感染结核病，造成的直接经济损失达30多亿美元[1]。另据报道，世界上结核病患者中约有15%是通过饮用了结核病牛所产的牛奶而患病的。牛结核病的流行不仅严重影响到养牛业，尤其是奶牛业的健康持续发展，而且由于交叉感染使人类的健康受到威胁。因此，世界各国均采用检疫和扑杀政策控制牛结核病，但是牛分枝杆菌宿主广泛，防控方法单一，净化相当困难。我国牛结核病的流行状况尚不清楚，但总体呈上升和蔓延趋势，在牛结核病的综合防控和净化方面面临着巨大挑战。

1 牛分枝杆菌的病原学特征

牛结核病主要是由分枝杆菌属牛分枝杆菌引起，另外还有结核分枝杆菌和禽分枝杆菌。其中，结核分枝杆菌主要感染人，也可引起牛结核病；禽分枝杆菌主要感染家禽，也可感染牛、猪和人[2]。

牛分枝杆菌为棍棒状，较粗短，不产生芽孢和荚膜，也不能运动，属于革兰氏阳性菌，用一般染色法较难着色，常用萋-尼氏抗酸染色法染色。该菌为专性需氧菌，最适生长温度为37.5℃，最适pH值范围为5.9～6.9，在培养基上生长非常缓慢。在含有牛血清或鸡蛋的固体培养基上3周左右才开始生长，呈粟粒大的圆形细小菌落，稍干燥呈鳞屑状。

牛分枝杆菌富含类脂和蜡脂，对外界环境的抵抗力较强，对干燥、湿冷、腐败的耐受力很强。在干燥的痰液中可存活10个月，在病变组织和尘埃中可存活2～7个月，在水中可存活5个月，在粪便和土壤中可存活6～7个月，在乳中可存活3个月，在污水中可存活11～15个月。对热很敏感，60℃30min可将其杀死，在直射阳光下数小时可死亡，在100℃沸水中立即死亡，因此经巴氏消毒的乳制品已无危险。无机酸、有机酸、碱性物质和季铵盐类消毒剂对该菌无效，但在5%来苏儿、3%～5%甲醛液、70%酒精和10%漂白粉溶液中均可被杀死[3]。

2 牛结核病的流行病学

该病主要侵害牛，特别是奶牛，其次是水牛、黄牛，各年龄的牛均可感染。此外，由于牛分枝杆菌的宿主范围比较广泛，几乎可以感染大部分的温血脊椎动物，如人、猪、鹿、大象、猴、狒狒、狮子及禽类。

病牛和病人，特别是开放型患者是主要传染源，其粪尿、乳汁、生殖道分泌物、唾液、鼻液、痰液等均能排放病原菌，污染饲料、食物、饮水、空气和环境而散播传染[4]。家畜和人主要通过呼吸道和消化道感染，吸入被污染的飞沫或媒介是传播本病的最主要方式，也可以通过交配传播。犊牛主要是由于吮吸带病原菌的牛奶而感染，成年牛多因与患病牛、病人直接接触而感染。

该病多呈散发或地方性流行，无明显的季节性和地区性。饲养管理不当，如厩舍拥挤、通风不良、潮湿、阳光不足、卫生条件差及日粮营养不足、缺乏运动、使役过重等均可诱发本病。

3 牛结核病的临床症状

牛结核病的潜伏期长短不一，一般为10～45d，长者可达数月乃至数年，通常呈慢性经过。因病变器官不同，症状不一，临床中以肺结核、乳房结核及肠结核较为常见，还可见淋巴结核、生殖器结核、脑结核、胸膜结核等。

3.1 肺结核

以长期顽固地干咳为特征，且以清晨最为明显。病牛初期易疲劳，食欲、反刍无明显变化，常出现短而干的咳嗽，当病牛起立、运动和吸入冷空气时易发咳嗽。随病情发展，咳嗽加重、频繁，并转为湿咳，咳嗽声音较弱，且咳嗽时表现痛苦，呼吸次数增加，严重时发生气短。鼻液呈黏性、脓性，灰黄色，呼出气有腐臭味。胸部听诊常有啰音和摩擦音，叩诊有半浊音或清浊音。病牛逐渐消瘦、贫血，肩前、股前、腹股沟、颌下、咽及颈淋巴结肿大，纵膈淋巴结肿大时可压迫食道，引起慢性瘤胃臌气。病情恶化时，病牛体温升高至40℃以上，呈弛张热或稽留热，呼吸更加困难，最后可因心力衰竭而死亡。

3.2 乳房结核

病牛一般是乳房淋巴结肿大，继而两乳患病区发生局限性或弥散性硬结，硬结无热无痛，表面凹凸不平。泌乳量逐渐下降，乳汁初期无明显变化，严重时可变得稀薄如水。由于肿块形成和乳腺萎缩，两侧乳房变得不对称，乳头变形、位置异常，导致泌乳停止。

3.3 肠结核

病牛呈现前胃弛缓，食欲下降，消化不良，迅速消瘦，全身乏力，顽固性腹泻，粪便呈稀粥状，带有黏液和脓汁。直肠检查时，腹膜粗糙不光滑，肠系膜淋巴结肿大。

3.4 淋巴结核

可见于结核病的各个病型，常见颌下、咽、颈、肩前、股前及腹股沟等部位，淋巴结肿大突出于体表，无热痛。咽后淋巴结肿大时，压迫咽喉，呼吸音多粗厉、响亮；肩前和股后淋巴结肿大时，可引发前后肢跛行。

3.5 生殖器结核

病母牛从阴道中流出透明的黄白色黏液，混有血液和干酪样絮片或脓液；情期紊乱，发情次数增加，但不易受孕；妊娠牛易流产。病公牛附睾肿大，发硬，阴茎前部出现结节、糜烂。

3.6 脑结核

病牛多呈神经症状，如惊恐不安、兴奋、肌肉震颤、站立不稳、步态蹒跚、头颈僵硬、眼肌麻痹等，病程后期可见痉挛、昏迷、呼吸与心率失常。

4 牛结核病的病理变化

剖检可见多种组织器官形成肉芽肿或粟粒样结节，以肺和淋巴结最为多见。肺部出现针尖至鸡蛋大小的黄白色坚硬结节，切开时有砂砾感，结节中心有干酪样坏死或钙化灶，有的软化、溶解形成空洞。胸膜和腹膜表面形成一些粟粒至豌豆大小、半透明的灰白色、较坚硬的结节，形似珍珠状，又称为“珍珠病”。肠结核发生于小肠或盲肠，肠黏膜可见大小不等的结核结节或局灶性溃疡，溃疡周围呈堤状，底部坚硬并覆有干酪样物。乳房结核多发生于进行性病例，剖开可见有大小不等病灶，内含有干酪样物质，还可见到急性渗出性乳房炎的病理变化。

5 牛结核病的检测方法

5.1 传统分离培养法

严格按照《结核病诊断细菌学检验规程》，对采取的组织病料或痰液进行一定的处理，将收集到的分枝杆菌接种于酸性罗氏培养基上，约1个月后可见黄色粗糙米粒状菌落即判定为牛分枝杆菌或结核分枝杆菌。此种方法主要依赖于分枝杆菌的生物学特性和培养特征，能获得细菌菌落进行定量，可以检测到1×102～1×103个菌/mL，实验成本低廉，但是检测耗时较长（1～2周或更长），培养过程中容易污染，总体检出率也高，还需要运用其他方法进一步验证菌株特异性[5]。

5.2 结核菌素试验

结核菌素试验（PPD）是目前国内外应用最多的牛分枝杆菌检测方法，也是OIE推荐的牛结核病诊断方法，具有灵敏、简单和价廉的特点。结核菌素是从结核菌中分离得到的菌体蛋白，并经饱和硫酸铵或三氯醋酸粗提与纯化制成的诊断制品。如果机体感染过结核病，免疫B细胞会对结核分枝杆菌产生记忆，当再次用结合菌素去刺激机体，机体会产生超敏反应性炎症，导致皮肤增厚。其结果判断标准为：增加4mm为阳性，2～4mm为可疑，2mm以下为阴性。PPD皮试的缺陷有：工作量和劳动强度大，检测时间间隔较长，测量皮厚时存在人为误差，结果判断主观性强，同时也存在一定非特异性反应。

5.3 IFN-γ体外释放检测法

IFN-γ体外释放检测是一种细胞免疫检测方法，IFN-γ主要是由活化的T淋巴细胞及自然杀伤细胞产生，可以用PPD刺激被检抗凝全血中的淋巴细胞24h，由于免疫细胞存在记忆性，如果是已致敏的免疫细胞就会产生大量的IFN-γ，通过检测IFN-γ的数量变化，来间接检测机体是否感染了结核分枝杆菌。此种方法灵敏度与特异性均较高，操作快速简单，只需要较少的血液样本[6]，可实现批量检测。但是IFN-γ的产生依赖于记忆性免疫细胞，本身也缺乏一定特异性，采血后需在24h内进行刺激，只能检测特定时期的感染情况，成本也较高。

5.4 抗体检测法

由于抗体检测法快速、简便，可大批量检测，便于实现自动化，具有很好的应用前景，目前的抗体检测法有ELISA与胶体金试纸条2种。

ELISA检测法通过将结核分枝杆菌的特异性抗原包被到固相载体上，对血清中的特定抗体进行定性和定量检测，是一种间接检测结核分枝杆菌的方法。此种方法由于ELISA试剂盒的普遍商品化而更加经济实惠，样本易得，实验操作也简单快捷，可以进行辅助性诊断。但是不同蛋白的特异性不一样，检测时敏感性和特异性存在一定的差异性。

胶体金试纸条是利用免疫学原理检测牛结核抗体的一种简单快速的方法，建立在胶体金颗粒的特异结构和特性上[7]。当胶体金颗粒上的特异性结核抗原与血清中的结核抗体结合，随着层析效应与检测线上能与抗体反应的抗原结合时，出现一条红色的阳性检测线，而当颗粒继续移动到达质控线，结核抗原会与预先固定好的相应抗体结合而控制试纸条的质量。此方法也存在一定缺点，如试纸条受各种理化因素影响较大，要用特定的缓冲液稀释，检测的灵敏度易受影响等。

5.5 PCR和多重PCR检测

PCR和多重PCR检测技术是利用多聚酶链式反应直接检测样品中的结核分枝杆菌，相对免疫学的间接检测方法则更具有检测意义，已应用于各医院的结核病诊断及各牛场的牛结核病检测和流行病学调查中。当得到被检样品，如全血、奶样、组织、痰液等标本后，进行样本的初处理，去除脂类和一些杂质，然后集菌并加裂解液或直接煮沸裂解，获得的结核菌DNA样本就可以作为PCR的模板。PCR是针对结核分枝杆菌特异性的基因设计引物，而多重PCR则是针对多个特异基因设计引物，进行多聚酶链式反应扩增，得到特异性的目的条带，从而特异性检测出结核分枝杆菌。多重PCR相对PCR而言更方便快捷、经济实惠、工作量小，一次反应可以检测多个目的基因，但是引物设计要更复杂，对设备和人员的要求也更高[8]。

6 牛结核病的综合防控措施

6.1 预防为主，积极研发新技术

随着人类对结核病防控认识的进一步深入，发现根除动物结核病其实是根除人类结核病的必要前提。由于动物饲养量及流动量大幅增加、野生动物的活动及国际贸易的日益频繁，牛结核病的流行率不断上升，以预防为主的疫苗免疫越来越受关注。目前，结核疫苗是医学领域研究的热点之一[9]，国内外已开展一系列结核病新型疫苗的研究，而且借鉴人类结核疫苗的开发经验，动物疫苗研制的后发优势将比较明显。鉴于卡介苗（BCG）的高安全性，已将BCG用于牛结核病的预防以检验对牛和其它野生动物的保护力，同时通过各种途径来提高BCG原有的保护力和寻找BCG的替代物。

除了结核疫苗外，需积极研发、利用新型技术和手段来加强牛结核病的预防。例如，可将先进的电脑系统利用到整个牛结核病的防疫体制，利用地理信息系统（GIS）或地球定位系统（GPS）进行牛结核病流行病学的监测与可追溯[10]，能随时关注全国的检疫动态。

6.2 加强检疫，防止疫病传入

无结核病的健康牛群应每年春、秋各进行1次结核菌素变态反应检疫，以便及时发现病牛，清除传染源，净化牛群。在引进牛时，先进行产地检疫，确认为阴性方可引进，运回后隔离观察1个月以上再进行检疫，确认健康后方可混群饲养。

尽量减少牛群接触病原菌的机会，牛分枝杆菌的主要宿主是牛，但獾、白尾鹿等野生动物宿主也是感染牛的重要传染源。因此，牛舍内不能同时饲养其它牲畜及禽类，防止可能隐匿分枝杆菌。同时，对已严重污染的场地实行关闭、停产，防止因消毒不彻底或在原场地生长的各种带菌动物对牛群造成感染[11]。

6.3 隔离扑杀，净化污染牛群

对检出的阳性牛原则上应立即扑杀，也可以隔离饲养，并定期进行检疫；发现开放性结核病病牛时，应立即扑杀，尸体要进行深埋或焚烧等无害化处理。优秀的高产奶牛或种牛患病，可用链霉素、异烟肼利福平等药物进行治疗。对疑似病牛应隔离饲养，1个月后进行复查，如仍有疑似反应，要继续隔离饲养，再经25～30d进行复查，如还有疑似反应，可按阳性牛进行处理。

对污染牛群，每年进行4次以上检疫，检出的阳性牛及可疑牛要立即分群为阳性牛群与可疑牛群。剔除阳性牛及可疑牛后的牛群，应间隔30～45d检疫1次，连检3次均为阴性者，认为是健康牛的可放入假定健康牛群。假定健康牛群为曾经检出结核阳性牛，且每年检疫阳性率在3%以下的牛群，需每年进行2次以上定期检疫。当无阳性牛出现时，再经过1.0～1.5a连续3次检疫，结果均为阴性时，可确定为健康畜群[12]。

6.4 坚持消毒，培养健康犊牛

每年定期（2～4次）对整个牛舍及周围环境进行全面消毒，消灭传染源与传播媒介。饲养场或牛舍进出口处要设置消毒池，内置有效消毒剂，如3%～5%来苏/L溶液或20%石灰乳等，对进出的车辆、饲养人员、兽医人员要严格消毒。牛舍、运动场每月消毒1次，饲养用具每10d消毒1次；金属设施、设备可采取火焰、熏蒸等方式消毒，饲料、垫料可采取深埋发酵处理或焚烧处理；产房每周进行1次大消毒，分娩室在临产牛生产前及分娩后各进行1次消毒。

病牛专门设置分娩室，分娩前消毒乳房及后躯，所产犊牛立即与母牛隔离，人工喂健康牛的初乳5d，之后喂健康牛乳或消毒乳。犊牛应在6个月隔离饲养中分别于20～30、100～120和160～180d进行3次检疫，均为阴性反应的牛可转入假定健康牛群；阳性犊牛全部淘汰；可疑犊牛需在30～45d后复检。

6.5 加强管理，提高防疫意识

饲养管理人员要定期体检，取得健康证后方可上岗，严禁互相串岗，非工作人员不得随意出入牛场，避免人畜互相传染。

检疫部门应加强牛场疫病防治工作的指导和监督，建立健全奶牛防疫制度，全面实行奶牛健康证和户口台帐管理，所有奶牛都应登记造册，及时记录奶牛存栏和调运状况。对健康奶牛发给奶牛结核病检疫合格证明，凭证销售牛奶或转让健康牛，以保障奶牛业的健康发展。同时，定期开展牛结核病的监测、检疫，督促牛场及时扑杀病牛，不留隐患，指导并监督消毒和防疫措施的实施。

6.6 制定有效的防控和净化计划

由于宿主范围广泛、感染与发病过程缓慢、潜伏感染普遍、几乎无现代化的控制手段（无疫苗、无药物、无快速高通量检测方法），牛结核病的控制和根除是一个循序渐进的漫长过程[13]，需要制定有效的防控和净化计划，并长期保持信心和热情。

加强对牛结核病及野生动物结核病的流行病学调查研究，实施高覆盖率采样，整合相关调查结果，彻底摸清病原流行及分布特点，为牛结核病的防控和净化打下坚实的基础。学习发达国家控制牛结核病的重要措施和成功经验，加大牛群流动监管力度，减少区域之间的无序流动现象，建立完整的可追溯体系，实现区域化管理。同时，健全更新牛结核病的相应政策法规，提高公众对牛结核病防控意义的认识，各级政府、各级官员、专家、兽医防疫人员、养殖业主和消费者等多方面力量相互配合，为有效控制牛结核病提供保障。

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