肠道急性移植物抗宿主病黏膜通透性与肠黏膜病理改变的相关性研究

蔡芳芳 庄 强 朱融和 梁 彬 俞 康 江松福

消化道是急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)的重要靶器官，也是重要的aGVHD放大系统［1］。如何早期评估肠道功能屏障，早期阻断这一始动环节，减少aGVHD的发生显得至关重要。目前临床上仍缺乏安全有效的检测手段。本研究采用小鼠异基因骨髓移植模型，研究aGVHD肠道通透性及其严重程度的关系，旨在为早期肠道aGVHD提供较敏感的检测指标。

材料与方法

1.aGVHD小鼠实验模型［2］:SPF级雌性 BALB/C(H-2d)小鼠，6～8周龄，体重18～22g。实验动物均购自温州医学院，许可证号:SYXK(浙)2005-0061。随机分为单纯照射组(对照组)和aGVHD移植后第7、11和15天组，每组8只。TBI组接受直线加速器全身照射(总剂量:8.0Gy，照射距离:50cm，照射时间:8min，剂量率:1.0Gy/min)。对照组只接受TBI照射，与实验组同步喂养。

2.仪器:直线加速器(VARIAN CL2300C/D，美国);美国Agilent 1100高效液相色谱系统;美国 Agilent INTERFACE 35900E信号转换器;法国SEDERE SEDEX75蒸发光散色检测器;NH2色谱柱(Agilent，美国);7500 Real Time PCR System(ABI公司，美国);台式高速离心机 (BECKMAN公司，美国)。

3.试剂:乳果糖标准品和甘露醇标准品(色谱纯，Sigma公司);乙腈(色谱纯，Fisher Scientific公司);异丙醇(色谱纯，天津四友试剂公司);甲醇(分析纯，天津四友试剂公司);超纯水(Millipore公司，法国)。

4.给药方法及尿样采集:受试前所有小鼠禁食8～12h，取0.5ml乳果糖/甘露醇混合液(含乳果糖60mg/ml，甘露醇40mg/ml)，用灌胃器插小鼠食管上端缓慢灌注。收集6h尿液，记总量，将尿样置于-20℃保存，待尿样收齐后检测。分别采集对照组小鼠和aGVHD后第7、11和15天小鼠的6h尿液。

5.尿样预处理:取冰冻贮存的尿液样品解冻、摇匀，将尿样离心(12000r/min)30min，以去除尿中的沉淀物。再经0.22μm滤膜去蛋白颗粒。用超声波脱气20min后上机分析待检。

6.色谱条件参考文献［3］的方法:色谱柱:Agilent NH2色谱柱(4.6mm×250mm×5um)，柱温为30℃，流动相为乙腈:水(83∶17)，流速为 1.0ml/min，进样量为 20μl，ELSD 检测器漂移管温度:40℃;载气压力:3.0bar;电信号放大系数:4。

7.肠组织病理改变及评分标准:光镜下观察组织学变化，评价小肠aGVHD程度，并进行相关性分析。小肠aGVHD严重程度按Thomas GVHD病理组织学分级标准判定［4］。0度(0分):肠黏膜绒毛正常。Ⅰ度(1分):肠黏膜隐窝腺体扩张，个别上皮细胞坏死。Ⅱ度(2分):同Ⅰ度，肠腺坏死脱落。Ⅲ度(3分):同Ⅱ度，灶性黏膜裸露。Ⅳ度(4分):弥漫性黏膜裸露。每个时间点选取清晰的切片8张，每张切片于光镜下(×400)随机取5个视野，由有经验的病理科医师进行盲法评分。

结 果

1.肠道通透性比较:肠道通透性以乳果糖和甘露醇排出率的比值(L/M)表示。肠道aGVHD后7、11和15天组尿中乳果糖和甘露醇排出率的比值(L/M)均明显高于对照组，分别为0.509±0.353，0.717±0.012，0.762 ±0.014，0.291 ±0.053，差异有统计学意义(P＜0.05)，并随着时间的延长，L/M比值逐渐增高。

2.移植后肠道组织病理变化及aGVHD严重程度评分:异基因移植组根据存活期、外周血白细胞计数、临床表现及病理检查等均可在相对集中的时间内(8～15天)观察到典型的aGVHD改变。第7、11天可见肠道病理GVHDⅠ～Ⅱ度改变，肠黏膜上皮细胞轻中度坏死脱落，黏膜下有少量淋巴细胞浸润。第11～15天可见肠道病理GVHDⅡ～Ⅲ度改变，黏膜上皮坏死脱落，黏膜下层充血水肿，黏膜下层与固有层有较多淋巴细胞浸润，隐窝细胞有变性坏死，腺体有淋巴细胞浸润;皮肤可见散在的炎细胞;肺泡壁可见充血、渗出、淋巴细胞浸润。未见明显的Ⅳ度改变。移植后第7天，即发现肠道黏膜上皮细胞有轻度坏死脱落，黏膜下有少量淋巴细胞浸润，移植后第11天肠道黏膜损伤程度进一步加重，肠道aGVHD呈上升趋势，第15天时损伤达到最重，肠道aGVHD严重程度评分大幅度上升。aGVHD后7、11和15天组aGVHD严重程度评分较对照组显著增加(P＜0.05)，分别为0.810±0.259，1.940 ±0.176，2.750 ±0.267，0.000±0.000。

3.aGVHD各组L/M与肠道aGVHD严重程度相关性分析:经 Spearman分析，尿 L/M比值与肠道aGVHD严重程度呈显著正相关(r=0.903，P＜0.01)。随着肠道通透性的增加，肠道aGVHD严重程度越重。

讨 论

减少严重GVHD发生和降低移植相关死亡的关键在于预防GVHD的发生。消化道是aGVHD重要的靶器官之一，肠道屏障功能障碍、肠内细菌及内毒素移位是导致肠道aGVHD的一个重要因素，严重影响了HSCT的预后［5，6］。由于肠黏膜通透性变化可准确反映肠屏障功能状态，对预示疾病过程中转归具有主要意义［7，8］。所以，临床上对 aGVHD 患者如能进行肠道通透性监测，将对减少肠源性感染的发生并及早采取防治对策，降低病死率有十分重要的作用。

肠黏膜屏障主要由肠黏膜上皮细胞和细胞间紧密连接构成。以乳果糖和甘露醇作为探针能够检测肠通透性的改变。通常情况下，甘露醇分子质量小，可经跨膜途径以简单扩散的方式被动吸收，而乳果糖分子质量大，不能穿过泡膜和细胞间紧密连接，只有极少量被吸收，当肠黏膜受损时，高分子乳果糖则可通过细胞膜旁径路被大量吸收，使L/M比值增加，故测定尿中L/M比值可间接准确地反映肠通透性改变，广泛用于肠黏膜通透性的评估，而通透性改变则可反映肠黏膜的损害程度［9］。庄强等［3］采用 HPLC-ELSD检测小鼠尿液中乳果糖和甘露醇含量，具有简便、专一灵敏、重复性好、准确可靠等特点，可用于aGVHD小鼠肠道通透性的测定和监测。本研究通过建立 aGVHD小鼠模型，采用 HPLC-ELSD检测aGVHD组尿乳果糖和甘露醇的排出量，结果发现aGVHD后各组L/M值较对照组增加，且随着时间的延长而不断增加，与文献［10］报道一致。

研究结果表明，肠道aGVHD后肠黏膜结构遭到严重破坏，导致肠黏膜屏障功能减弱，使细菌的降解产物如 LPS进入血液，引发“细胞因子风暴”，是aGVHD致靶器官各种病理损害的重要原因之一［5，6］。本研究通过对肠道通透性与肠道aGVHD严重程度相关性分析结果表明，aGVHD后肠黏膜通透性与肠道aGVHD严重程度呈显著相关性，即肠道通透性增加，肠道aGVHD严重程度越重。这一结果提示，肠道通透性与肠道损伤程度有着密切的关系。aGVHD引起肠道黏膜细胞损伤、黏膜通透性增加。

检测尿中L/M比值变化方法简单易行，为无创伤指标，克服了常规通过胃肠镜活检判断aGVHD肠道病变严重程度的缺陷，能动态反映肠黏膜屏障功能状况，在肠道aGVHD的评估中具有临床应用价值。它及时在早期发现并判断肠屏障的受损程度，为降低aGVHD的发生率和病死率提供了有力的无创指标。

1 Johansson JE，Ekman T.Gut toxicity during hemopoietic stem cell transplantation may predict acute graft-versus-host disease severity in patients［J］.Dig Dis Sci，2007，52(9):2340-2345

2 蔡芳芳，俞康，江松福.小鼠异基因骨髓移植急性移植物抗宿主病模型的建立［J］.温州医学院报，2009，39(4):320-324

3 庄强，俞康，江松福.全身照射小鼠模型肠道通透性HPLC-ELSD检测方法的建立［J］.温州医学院报，2010，40(3):224-228

4 何长民，石炳毅.器官移植免疫学［M］.北京:人民军医出版社，1995:351-368

5 Ferrara JL，Reddy P.Pathophysiology of graft-versus-host disease［J］.Semin Hematol，2006，43(1):3-10

6 Copelan EA.Hematopoietic stem-cell transplantation［J］.N Engl J Med，2006，354(17):1813-1826

7 Fink MP.Gastrointestinal muosal injury in experimental model of shock，trauma and spesis［J］.Crit Care Med，1991，19(5):627-641

8 Lunn PG，Northrop-Clewes CA，Downes RM.Intestinal permeability，mucosal，and growth fatering in Gambian infants［J］.Lancet，1991，338(8772):907-910

9 Dumas F，Aussel C，Pernet P，et al.Gas chromatograply applied to the lactulose2mannitol intestinal permeability test［J］.J Chromatogr B，1994，654(2):276-281

10 Melichar B，Hyspler R，Dragounová E，et al.Gastrointestinal permeability in ovarian cancer and breast cancer patients treated with paclitaxel and platinum［J］.BMC Cancer，2007，7:155