小鼠模型在甲状腺癌研究中的应用进展

郑永胜(综述)，苏国强(审校)

(福建医科大学第一临床医学院，厦门大学附属第一医院普外科，福建厦门 361003)

小鼠模型在甲状腺癌研究中的应用进展

郑永胜△(综述)，苏国强※(审校)

(福建医科大学第一临床医学院，厦门大学附属第一医院普外科，福建厦门 361003)

甲状腺癌是最常见的甲状腺恶性肿瘤，我国近年甲状腺癌的发病率呈逐年上升趋势。小鼠动物模型在研究甲状腺癌的发生、发展及药物治疗中发挥着重要作用，目前用于甲状腺癌研究的主要小鼠模型包括自发性小鼠模型、诱发性小鼠模型、基因工程小鼠模型、移植性小鼠模型和最新报道的在特定时间和特定组织激活或灭活靶基因的限制性小鼠模型。

甲状腺癌;小鼠模型;动物实验

甲状腺癌占所有实体肿瘤的1%，是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，也是近年发生率上升最快的恶性肿瘤之一［1］。甲状腺癌动物实验的研究已经多年的历史，理想的动物模型应该真实地反映人类甲状腺癌的发病机制、肿瘤对人体侵害引起的生物化学变化、生物学行为和形态学的改变及对实验药物疗效的一致性等。2002年小鼠基因组的测序工作证实小鼠与人类基因相似，且在生理学、生物学许多特性方面也极其相似，是肿瘤研究的理想动物模型。而且目前的技术能够在鼠的基因水平上设计与人类疾病相关的基因突变而获得相关疾病模型［2］。小鼠模型是目前可以整合基础和临床肿瘤研究的武器，已应用于肿瘤研究的各个领域。在甲状腺癌研究中，目前已经建立了一些小鼠实验模型，能近似地模拟甲状腺癌的某些特征，但是不能完全模拟人类甲状腺癌的全部特征，因此，应根据研究的需要来选择不同的动物模型，达到最好的研究效果。

1 自发性肿瘤模型

自发性肿瘤模型是近交系肿瘤疾病模型，是最早被报道的动物模型，自发肿瘤小鼠在自然情况下产生肿瘤，未经任何有意识的人工处理，肿瘤的发生、发展与人类肿瘤很相似，具有很高的价值。近年来十分重视对自发的动物疾病模型的研发，以发现自发性疾病的病例，而后通过遗传育种，将这种自发性疾病模型保持下来，并培育成具有特定遗传性状的突变系，以供研究。

选用自发性肿瘤模型的优点有以下几个方面：①自发性肿瘤通常比用实验方法诱发的肿瘤与人类所患的肿瘤更为相似，有利于动物实验结果反推用到人;②这一类肿瘤发生的条件比较自然，有可能通过细致的观察和统计分析而发现原来没有发现的环境因素或其他的致癌因素，可以着重观察遗传因素在肿瘤发生上的作用［3］。由于小鼠自发甲状腺癌的发生率极低，难以获得并应用于甲状腺癌的研究，尽管使用近交系小鼠增加了甲状腺癌的发生率，仍不能很好地实现实验的可预测性和可重复性。

2 诱发性肿瘤模型

诱发性肿瘤模型是通过使用物理、化学和生物的致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身一定的损害，出现某些类似人类肿瘤的功能、代谢改变，如用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤。1960年Israel等［4］为观察甲状腺癌的潜在发生率，分别用空白组、丙硫氧嘧啶组和无碘饮食组三组小鼠甲状腺癌模型，最终丙硫氧嘧啶组和无碘饮食组成功诱导小鼠甲状腺癌。2011年Lieberman等［5］利用放射核素诱发小鼠肿瘤等实验中甲状腺癌发生率排第3位。

诱发性肿瘤模型具有能在短时间内复制出大量疾病模型，并能严格控制各种条件使复制出的肿瘤模型适合研究目的需要等特点，因而为近代医药研究所常用。但难以观察肿瘤的动态发生、发展，常缺乏客观测量肿瘤发生、发展或退缩的指标，且诱发模型和自然产生的肿瘤模型在某些方面毕竟存在一些差异，因此设计诱发性肿瘤模型要尽量克服其不足，发挥其特点。

3 基因工程小鼠模型

人为地运用各种生物技术手段有目的地干扰小鼠的基因，导致小鼠新的性状的出现并能够有效地遗传下去，形成新的可供生命医药所需要的肿瘤模型，称基因工程小鼠模型。包括转基因模型、基因剔除模型、基因替换模型及最新报道的限制性小鼠模型。

3.1 转基因小鼠模型 Gordon等［6］在20世纪80年代发现了转基因小鼠技术。转基因小鼠是指通过不同的方法将外源基因导入小鼠受精卵，然后产生携带外源基因的小鼠品系，并能通过生殖细胞将外源基因传递给后代的小鼠。2009年Diallo-Krou等［7］利用转基因小鼠观察成对第8基因过氧化物酶体增殖活化受体和磷酸酶、张力蛋白沉默协同对甲状腺癌癌组织生长的影响。2011年Lee等［8］利用转基因小鼠模型观察BRAFV600E激酶和蛋白激酶MST1途径在甲状腺癌发生过程中的关系。转基因小鼠模型已广泛应用于肿瘤的发生机制、免疫耐受性、胚胎发育、基因治疗等方面研究。目前转基因技术主要有显微原核注射法、反转录病毒感染法、胚胎肝细胞介导法、体细胞核移植技术、精子载体法、胞质内单精子注射法和卵母细胞载体法等［9］。

转基因小鼠的产生有助于人们理解化学药物和肿瘤基因相互作用的机制，成为研究甲状腺癌发生机制的有力手段。随着新的肿瘤基因和肿瘤抑制基因的发现以及一些新技术的引入，例如，用于转基因的可控表达系统，基因定位剔除技术等，会使转基因小鼠技术进一步完善，小鼠肿瘤模型更加接近实际情况，更有力地揭示甲状腺癌的发生机制。

3.2 基因剔除小鼠模型 基因剔除［10］20世纪是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新的技术，是指借助分子生物学、细胞生物学和动物胚胎学的方法，通过胚胎肝细胞这一特殊的中间环节将模式生物正常的功能基因的编码区破坏，使特定基因失活，以研究该基因的功能，或者通过外源基因来替换宿主基因组中的相应部分，以便测定它们是否具有相同的功能，或者将正常基因引入宿主基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。1989年 Thompson等［11］通过基于 ES细胞囊胚注射的基因剔除，建立了次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因被定点剔除的小鼠模型。Fedele等［12］利用基因剔除小鼠模型研究p27kip1功能沉默对甲状腺癌的影响。该模型的建立为肿瘤的诊断和治疗提供了很好的靶子。通过对该模型的研究，许多与甲状腺癌相关的新基因的功能得到阐明，从而导致抗肿瘤领域中许多突破性进展。

3.3 基因替换小鼠模型 基因替换是将有功能的正常基因转移到疾病细胞中，通过替换病变细胞内的致病基因，或整合到基因组的某一位点或独立于基因组之外表达，以替代缺陷基因发挥作用。基因的突变或缺失是肿瘤发生的重要原因，这些基因包括抑癌基因(如 p53，Rb)，促凋亡基因(如 bax，caspases)以及一些细胞周期调控基因等。把上述正常基因导入肿瘤细胞内，将有可能逆转由于相应基因突变导致的恶性表型。2010年Randall等［13］利用基因小鼠替换模型研究活化炭疽致死毒素抑制未分化型甲状腺癌癌组织血管金属激酶。虽然基因小鼠替换模型现在仍不是很成熟，但有望成为甲状腺癌基因治疗研究方向重要的模型。

3.4 限制性小鼠模型 限制性小鼠模型是指在某些特定条件下利用生物工程技术的小鼠甲状腺癌模型。Ouyang等［14］利用小鼠模型成功的观察了RET/PTC或BRAF基因突变的甲状腺癌细胞在Raf激酶活性抑制下生长受阻。限制性小鼠模型能很好地模拟人甲状腺癌，且能观察在特定条件下的肿瘤变化，有利于对肿瘤基因的研究。

基因工程小鼠模型可按照研究目的进行设计和培育，其建立过程的本身就可进行疾病机制的研究。不但能从小鼠整体水平和组织器官水平上进行研究，而且还可以深入到细胞水平和分子水平，为发病机制、药物筛选和临床医药研究提供比较理想的实验体系。转基因技术克服了物种见的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组。从理论上讲，随着基因工程的发展，已可能在体外培育小鼠细胞中对任何一个或几个已知基因组结构和DNA序列的位点进行各种类型的遗传修饰。但是基因调控机制十分复杂，目前基因工程模型提供的信息还很局限，如导入一个癌基因可能激活另一个癌基因，从而导致了特异性肿瘤的发生。

4 移植性小鼠模型

移植性小鼠模型是指将肿瘤到小鼠身上使其生长发育，是建立肿瘤模型的另一种重要的方法。2010年张富海等［15］在裸鼠两髋外侧皮下接种甲状腺癌细胞后，观察核因子κB抑制剂与多烯紫杉醇联合治疗下甲状腺癌瘤体增长情况。目前移植性肿瘤动物模型所遇到的困难是移植物受到宿主免疫排除、生长缓慢、不能稳定长期传代和不便于观察。

4.1 免疫缺陷小鼠 由于裸小鼠和严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠的应用，人类的肿瘤在受体小鼠内的异种移植得到实现，而不受到移植排斥。1962年Grist在非近交小鼠中发现了无毛小鼠，1966年Flanagan将其命名为裸鼠，1968年 Pantelouris等［16］发现，这种动物为无毛、无胸腺动物。1969年，Rygaard等［17］成功地将人结肠癌细胞移植于裸鼠，建立了人肿瘤异位移植模型。20世纪70年代初，Giovanella等［18］报道，一些体外培养的人癌细胞系也相继成功地移植于裸鼠，从而在人体外建立起了人体肿瘤的整体研究体系。裸小鼠11号染色体上的隐形裸基因突变而无被毛，先天性无胸腺或仅有异常的胸腺上皮，不能分泌胸腺素使T细胞正常分化，细胞免疫力低下［19］。SCID小鼠在1983首先发现于C.B-17的同源近交系，是第16号染色体上称scid的单个隐形基因所致，SCID是CB-17/IcrJ的同源近交系。SCID小鼠的所有T和B淋巴细胞功能测试均为阴性，对外源性抗原无细胞免疫及抗体反应，体内缺乏携带前B细胞、B细胞和T细胞表面标志的细胞。但是，其非淋巴性造血细胞分化不受突变基因的影响，巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、红细胞等呈现正常状态，自然杀伤细胞及淋巴因子激活细胞也呈正常状态，对人类的移植物能产生排斥反应，是肿瘤研究的理想动物模型。随着分子生物学的发展及基因工程技术的进步，通过转基因技术将肿瘤相关基因转入小鼠的基因中，产生特定的肿瘤动物模型;或者将肿瘤相关基因剔除，研究肿瘤与相关基因的关系。

4.2 移植的材料 移植的肿瘤来源包括裸鼠体内的移植甲状腺瘤、手术切除的人类甲状腺癌组织、人甲状腺癌细胞株等。肿瘤的来源、性质对移植的成功率有明显的影响，应用转移肿瘤组织作为移植物，其成功率高于原发肿瘤组织，转移率也较高;经传代培养或筛选过的高转移人癌细胞移植成功率和转移率都较高。用肿瘤组织块做移植物的优点在于肿瘤组织生长的微环境和原发肿瘤生长的微环境相近，缺点是不同的肿瘤甚至在同个肿瘤中所取的肿瘤组织存在异质性，使得实验缺少统一性和对比性，同时，人类肿瘤组织经常含有坏死区，影响移植后肿瘤的生长。

4.3 移植的方法及部位 移植的方法和部位有很多种，移植的部位包括：皮下、腹腔、静脉、原位移植。最简单甲状腺癌的小鼠移植主要有两种方法，最常用的一种方法是皮下注射，皮下注射方便观察肿瘤的生长情况，并且能够评估给予治疗药后的效果，但是，由于皮下注射肿瘤生长的微环境和原位生长的肿瘤的微环境有差别，肿瘤具有不同的特征，比如生长因子的水平、营养素和肿瘤的血管发生、转移的行为等。另一种是原位移植，能较真实地反映肿瘤的生长、转移及侵袭情况，然而，小鼠甲状腺组织细小，原位操作上比较困难，移植物只能是细胞悬液。应用人甲状腺癌细胞作移植物时，有时需筛选出高转移癌系细胞，方法有将肿瘤细胞进行体外培养，选出转移性高的细胞亚群;在转移灶体内连续传代癌细胞，使具转移能力细胞亚群升高;将癌细胞与兴趣靶器官组织共同孵育，提高癌细胞和靶器官的亲和性;利用克隆技术，建立细胞株，产生较多含具有转移能力的干细胞。孙辉等［20］在2002年建立了人甲状腺未分化癌细胞系TA-K裸鼠原位移植模型，观察移植后肿瘤生长情况和转移规律。

4.4 移植性小鼠模型的应用及优缺点 移植肿瘤复制简单，生物学特性较稳定，实验的重复性好，实验结果可靠。能保存较长时间而特性不变，可以连续移植，长期供实验用。实验周期短，实验中花费的人力、物力较少，实验结果能较好地外推到人。但是由于不能完全模拟人类肿瘤的各种生物性特征，与人体自发肿瘤相比较移植性肿瘤生长速度快，核型固定，增殖比率高，倍增时间短。

5 小结

综上所述，小鼠甲状腺癌模型的研究，特别是利用分子生物学、基因工程等建立的各种小鼠模型，将是甲状腺癌研究的重要内容。随着各种技术的发展，人们将会逐渐了解甲状腺癌的发病机制、侵袭及转移过程等，从而找到治疗甲状腺癌的有效方法。由于各种甲状腺癌小鼠模型均不能完全模拟人类甲状腺癌的全部特征，因此，应根据研究的需要来选择不同的动物模型，达到最好的研究效果。

［1］代文杰，朱化强.甲状腺癌的分子靶向治疗［J］.中国实用外科杂志，2011，31(5)：456-457.

［2］梁朝霞.小鼠肿瘤模型的研究进展［J］.国外医学卫生学分册，2004，31(4)：212-216.

［3］邹移海，张永斌，连至诚.实验性大肠癌动物模型研究述评［J］.广州中医药大学学报，1997，14(4)：277-280.

［4］Israel MS，Ellis RI.The neoplastic potentialities of mouse thyroid under extreme stimulation［J］.Br J Cancer，1996，14(6)：206-211.

［5］Lieberman HB，Bernstock JD，Broustas CG，et al.The role of RAD9 in tumorigenesis［J］.J Mol Cell Boil，2011，3(1)：39-43.

［6］Gordon JW，Scangos GA，Plotkin DJ，et al.Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1980，77(12)：7380-7384.

［7］Diallo-Krou E，Yu J，Colby LA，et al.Paired box gene 8-peroxisome proliferator-activated receptor-γ fusion protein and loss of phosphatase and tensin homolog synergistically cause thyroid hyperplasia in transgenic mice［J］.Endocrinology，2009，150(11)：5181-5190.

［8］Lee SJ，Lee MH，Kim DW，et al.Cross-regulation oncogenic BRAFV600E kinase and the MST1 pathway in papillary thyroid carcinoma［J］.PLos One，2011，6(1)：e16180.

［9］左珂菁，苗向阳，谢青梅，等.转基因动物技术的研究进展及应用［J］.现代生物医学进展，2010，10(3)：560-566.

［10］桑景荭，刘欣.基因敲除小鼠在疾病研究中的应用［J］.生物学通报，2009，44(12)：3-4.

［11］Thompson S，Clarke AR，Pow AM，et al.Germ line transmission and expression of a corrected HPRT gene produced by gene targeting in embryonic stem cells［J］.Cell，1989，56(2)：313-321.

［12］Fedele M，Palmieri D，Chiappetta G，et al.Impairment of the p27kip1 function enhances thyroid carcinogenesis in TRK-T1 transgenic mice［J］.Endocr Relat Cancer，2009，16(2)：483-490.

［13］Alfano RW，Leppla SH，Liu S，et al.Inhibition of tumor angiogenesis by the matrix metalloproteinase-activated anthrax lethal toxin in an orthotopic model of anaplastic thyroid carcinama［J］.Mol Cancer Ther，2010，9(190)：190-201.

［14］Ouyang B，Knauf JA，Smith EP，et al.Inhibitors of raf kinase activity block growth of thyroid cancer cells with RET/PTC RET/PTC or BRAF mutations in vitro and in vivo［J］.Clin Cancer Res，2006，12(6)：1785-9317.

［15］张富海，孟召伟，谭建.核因子κB抑制剂与多烯紫杉醇联合治疗未分化甲状腺癌瘤的体内研究［J］.天津医药，2010，38(8)：686-688.

［16］Pantelouris EM.Absence of thymus in a mouse mutant［J］.Nature，1968，27271(5126)：370-371.

［17］Rygaard J，Puvlsen C.Heterotransplantation of a human malignant tumour to ＂nude＂mice［J］.Acta Parh Microbiol Scand，2007，115(5)：604-606.

［18］Giovanella BC，Yim S，Stehlin JS，et al.Brief communication：Development of invasive tumors in the＂nude＂mouse after injection of cultured［J］.J Natl Cancer Inst，1972，48(5)：1531-1933.

［19］Bankert RB，Egilmez NK，Hess SD.Human-SCID mouse chimeric models for the evaluation of anti-cancer therapies［J］.Trends Immunol，2001，22(7)：386-393.

［20］孙辉，王金国，张德恒，等.人甲状腺未分化癌细胞系TA-K裸鼠原位移植模型的建立［J］.基础与实验研究，2002，9(5)：322-324.

Advances on Mouse Models Application in Thyroid Cancer Research

ZHENG Yong-sheng，SU Guoqiang.(Fujian Medical University First Clinical College，General Surgery Department of the First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen361003，China)

Thyroid cancer is the most common malignant thyroid tumor.In recent years，the incidence of thyroid cancer is in an uptrend year by year in China.The experiments on mice have played an important role in studying the occurrence，development and drug therapy of thyroid cancer.Presently the major mouse model being used in studying thyroid cancer includes spontaneous，suppressive，genetic，transplanted and restricted mouse model reported recently activating or inactivating genes at a particular time and tissue.

Thyroid cancer;Mouse model;Animal experiment

R736.1

A

1006-2084(2012)13-2016-04

2011-11-21

2012-02-16 编辑：楼立理