细菌抗肿瘤作用的研究

杨旭光(综述)，杨志奇，孙振纲(审校)

(长江大学附属荆州临床医学院肝胆外科，湖北荆州 434020)

细菌抗肿瘤作用的研究

杨旭光△(综述)，杨志奇※，孙振纲(审校)

(长江大学附属荆州临床医学院肝胆外科，湖北荆州 434020)

恶性肿瘤对传统抗肿瘤疗法的抵抗促使人们寻找新的更有效的肿瘤治疗方法。研究显示某些细菌在感染人体后对肿瘤细胞生长有抑制作用，某些细菌可以在肿瘤组织中高度聚集，因此可能被用作抗肿瘤药物或基因的载体，细菌毒素同样显示出抗肿瘤的作用，目前对一些细菌已经进行了Ⅰ期临床试验，但各种细菌(包括致病性细菌)与肿瘤的关系仍然有待于进一步研究。

抗肿瘤;伤寒沙门菌;铜绿假单胞菌;细菌制剂;生物治疗

传统的肿瘤治疗方法虽然对某些特殊类型的肿瘤及一些早期恶性肿瘤有较好的效果，但低氧条件下化疗的细胞毒作用，手术操作的过程都有可能选择出恶性程度更高、更容易转移的癌细胞，对放化疗抵抗力更强的癌细胞，并且有使癌细胞扩散转移的可能［1］。总体来讲，传统疗法抗肿瘤治疗效果还不能令人满意，而细菌抗肿瘤有其特殊的优势，因为实体肿瘤组织生长迅速，内部血管分布不均，致使肿瘤内多属低氧代谢环境［2］，而细菌本身对乏氧肿瘤组织有很强的选择性［3］，能够在肿瘤组织中聚集并繁殖，而且有的直接抗肿瘤作用，有的可作为抗肿瘤药物载体运输或在肿瘤组织合成肿瘤细胞毒性分子，另外细菌可以被有效的抗生素清除，其不良反应明确并可控。细菌可以向肿瘤组织中心部位运动，可以刺激机体产生抗肿瘤效应分子，细菌毒素同样显示出有抗肿瘤的作用。尽管细菌及其制剂在抗肿瘤的历史中遭受过挫折［4-5］，但现在细菌抗肿瘤的作用正在重新引起人们的重视。

1 伤寒沙门菌

1.1 伤寒沙门菌抗肿瘤的作用机制特点 伤寒沙门菌是研究和使用最早的抗肿瘤细菌。过去应用灭活伤寒沙门菌制剂通过血液途径给药，发挥作用依赖血管的分布和有效的组织液浓度，不在血管外组织累积，几乎没有选择性，因此对肿瘤细胞作用有限，而具有运动能力的活细菌可以跨越灌注和压力梯度到血液分布少的肿瘤组织。

Forbes等［6］研究了几种候选伤寒沙门菌在肿瘤组织中聚集的机制，包括在肿瘤组织混乱的血管系统中停滞，被肿瘤特殊的微环境吸引，与肿瘤微环境的相互适应性反应。在系统静脉注射伤寒沙门菌到荷瘤小鼠后，相差显微镜和组织技术定量观察细菌和肿瘤血管的相互作用。发现在静脉注射后立刻有少量细菌黏附到肿瘤血管，注射后一周肿瘤组织中细菌数量是其他正常组织的10 000倍，充分显示了它们的特异性。肿瘤组织中的细菌定植在坏死区，距功能血管约750 μm。以上这些说明伤寒沙门菌黏附在肿瘤血管的能力有限，在肿瘤组织移动能力不足，只在肿瘤的坏死组织生存下来。伤寒沙门菌有很强的肿瘤组织特异性，增强它的运动能力应该可以提高治疗效果。

伤寒沙门菌可以在肿瘤组织中定植，但是目前对这种特异定植的机制知之甚少，Ganai等［7］研究了BALB/c小鼠乳腺癌4T1模型静脉注射鼠伤寒沙门菌后肿瘤组织中及周围的细菌含量与时间的关系，免疫组织化学法检测了凋亡，在核心、转移区、瘤体、边缘四个区域测量了细菌离开血管到定植点的距离，还检测率肺转移瘤和肝脏转移瘤中的细菌，测出沙门菌菌落增长1倍所需时间为16.8 h，细菌定植确定延迟肿瘤生长48 h，从定植后12～48 h，细菌定植点到功能血管的距离从1.30×10-4m增长到了3.10×10-4m，48 h后细菌从肿瘤边缘向肿瘤中心移动并诱导肿瘤细胞凋亡，96 h后细菌出现肿瘤过渡区，所有观察到的转移肿瘤组织中44%都发现了沙门菌，而正常肝组织中只有0.5%，证明沙门细菌可以渗透进入肿瘤组织并且可以选择性地定植到转移瘤组织。

1.2 伤寒沙门菌不同菌株抗肿瘤的研究介绍

1.2.1 VNP20009 的抗肿瘤作用研究 VNP20009［8］是伤寒沙门菌的减毒菌株，剔除了毒性基因msbB和purI后完全减毒(防止宿主中毒性休克)并依赖外源性嘌呤生存，这种依赖致使其在正常组织中不能复制，而在可以提供嘌呤的肿瘤组织中可以生长繁殖，具有抗生素敏感性，遗传稳定，这种细菌载体体外及动物实验表现出对长久的广谱抗肿瘤作用，甚至可以到转移瘤中定植［9］。VNP20009抗肿瘤Ⅰ期临床试验显示［10］，VNP20009是安全的，但无明显的抗肿瘤效果，VNP20009在浓度达3×108CFU/m2时实验动物未出现不良反应，在部分肿瘤组织内存在细菌聚集现象，减毒沙门菌VNP20009治疗肿瘤的临床试验引起的肿瘤坏死因子α比外周血中少1000倍，原因可能是过度的减低细菌毒性使得不仅不能诱导肿瘤坏死因子α产生，也不能诱导有效的炎性反应。

1.2.2 新型伤寒沙门菌抗肿瘤的研究 Hoffman［11］在实验室培育的亮氨酸缺陷型伤寒沙门菌被证实是一种对活的癌组织有效的细菌，对肿瘤组织有很高的毒力，在体外，A1-R突变株可以人感染肿瘤细胞导致细胞核碎裂。A1-R突变株开始用来治疗转移性前列腺癌和乳腺癌的裸鼠模型，40%的裸鼠被完全治愈，与对照组裸鼠生存时间一样长。静脉注射A1-R突变株对骨肉瘤肺转移的裸鼠模型有很高的疗效，尤其是对转移瘤疗效更好。A1-R突变株还可以通过淋巴途径定植于裸鼠人类胰腺癌模型和纤维肉瘤模型在腋窝和腘窝处淋巴结的肿瘤转移灶，也可以通过尾静脉注射定植到裸鼠纤维肉瘤的肺转移灶。转移瘤被治愈不需要化疗或其他治疗方法辅助。A1-R突变株被注射入裸鼠原位胰腺癌模型中，胰腺肿瘤消退同样不需要化疗等其他疗法辅助。当A1-R突变株在脾内注射对裸鼠胰腺癌肝转移同样有效。细菌单一疗法有效治疗原发性及转移性肿瘤相比以前的需要化疗药物辅助的细菌疗法有很大进步，三个启动子克隆被确定有利于细菌在肿瘤组织而不是在脾等其他正常组织生长。

1.2.3 基因工程改造的伤寒沙门菌抗肿瘤的研究关于沙门菌还有其他一些尝试取得了有希望的结果［12-14］，一种基因改造的精氨酸和亮氨酸营养缺陷性沙门菌在多个研究中表现出强烈的肿瘤组织定植特点，而在肝脏和脾脏中很快清除，这种细菌还表现出在多种肿瘤坏死组织和存活肿瘤组织中都能定植并引起肿瘤萎缩坏死。

重组嘧啶脱氨基酶的伤寒沙门菌［15］(attenuated S.Typhimurium engineered to express CDase，TAPET-CD)把大肠埃希菌嘧啶脱氨基酶基因转导入VNP20009的菌株，同样可以特异地定植到肿瘤组织中并繁殖，而且可以在肿瘤组织局部把无毒的氟尿嘧啶前体通过脱氨基作用转化为有细胞毒性作用的氟尿嘧啶，从而减小了氟尿嘧啶的全身毒性，提高了肿瘤局部的药物浓度，强化了抗肿瘤作用，而对肿瘤周围正常组织毒性大大减小。19F磁共振波谱分析显示了小鼠体内注射TAPET-CD后可以把氟尿嘧啶前体转化为氟尿嘧啶，氟尿嘧啶在肿瘤组织中浓度更高，浓度维持时间更长，导致肿瘤体积比单独用氟尿嘧啶或TAPET-CD注射明显减少。在三个晚期癌症患者的小规模实验［16］中，瘤内注射TAPET-CD证实是安全的，其中两个患者注射后细菌定植保持了15 d，患者也应用了氟尿嘧啶前体，证实可以转化为氟尿嘧啶，这两个患者的病情没有再恶化。这些前期实验说明了利用细菌携带功能基因在肿瘤组织把有效药物前体转化抗癌药物的可行性。另有研究［17］报道，TAPET-CD的抗肿瘤作用与细菌定植和嘧啶脱氨基酶表达没有明显关系，肿瘤生长延迟原因是酶的活动而不是嘧啶脱氨基酶的表达。

目前活的减毒细菌作为抗肿瘤的直接作用者和基因控制的前体药物酶疗法显示出是可能的治疗策略，VNP20009和TAPET-CD成功进行Ⅰ期临床实验，嵌合的毒素也在细菌毒素抗肿瘤的研究当中，一种cya/crp(调节AMP水平的基因编码蛋白)突变的沙门菌被基因工程改造后表达白细胞介素2用于肝癌治疗的研究也在进行中。

2 铜绿假单胞菌

2.1 铜绿假单胞菌介绍 铜绿假单胞菌是临床上较常见的条件致病菌之一。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)制剂是以普通铜绿假单胞菌为载体表达甘露糖敏感性菌毛的灭活制剂，是一种新型的广谱免疫调节剂，除了能作为大分子抗原刺激机体，全面提高和调节人体的体液免疫和细胞免疫功能外，其菌毛还能特异性地与高甘露糖表达型的肿瘤细胞结合，改变肿瘤细胞膜的结构和功能，使细胞生物学行为改变。PA的不良反应极低，因此已被临床用于感染、肿瘤及免疫相关疾病等的治疗，并取得一定的疗效［18］。

2.2 PA体外实验对人肿瘤细胞的作用研究 刘岩等［19］测定了铜绿假单胞菌-甘露糖敏感性血凝菌毛株菌疫苗(Pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hamemagglutination vaccine，PA-MSHA)对 HepG-2 细胞增殖的抑制作用，四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)结果表明，PA-MSHA对HepG-2细胞的增殖有抑制作用，且抑制程度与药物浓度和时间呈正比，具有时间-剂量依赖关系;Western blot检测结果显示PA-MSHA作用后，Bax、caspase-3蛋白表达上调，上调的程度随PA-MSHA浓度的增加而提高;Bcl-2蛋白表达下调，下调的程度随PA-MSHA浓度的增加而加大;细胞超微结构观察实验组符合细胞凋亡的特征。PA-MSHA处理12 h组：细胞器变性，细胞内出现较多空泡，细胞核轻度固缩，部分细胞线粒体可见空泡变，异染色质凝集成块。PA-MSHA处理24 h组：大部分细胞出现小泡，细胞核轻度固缩，细胞器变性;少部分核固缩明显，胞体固缩，细胞器减少。PA-MSHA处理48 h组：大部分形成凋亡小体，细胞器明显减少核固缩明显，细胞突起减少。本实验结果表明，高浓度组PA-MSHA可明显抑制裸鼠肿瘤的大小，肿瘤大小由1.70 cm3降到 0.68 cm3，抑瘤率达到60%，说明PA-MSHA于肿瘤局部注射时具有明显的抑瘤效果。在实验过程中，实验组小鼠状态良好，无明显不良反应，说明PA-MSHA，体内注射具有安全性。其具体的机制仍在研究中，一种从铜绿假单胞菌外膜蛋白来源的疫苗表现出免疫调节能力，一种失活的甘露糖敏感性红血球凝集菌毛的铜绿假单胞菌突变系(PA-MSHA)已经作为恶性肿瘤的辅助疗法来应用。

周建炜等［20］研究证实，PA明显抑制人肝癌细胞株MHCC97L细胞增殖和克隆形成，呈良好的剂量-效应关系。PA 48 h和72 h的半数抑制浓度分别为3.1×1011/L 和1.9×1011/L。PA 浓度为0.5 ×1011、1×1011、2×1011/L时，其细胞倍增时间依次增加，克隆形成率依次降低，表明在一定条件下，PA可抑制人肝癌MHCC97L细胞增殖和克隆形成，其作用部分是通过使细胞周期阻滞在G1期实现的;PA可以明显抑制MHCC97L细胞的侵袭、运动和迁移能力，其作用与血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶2蛋白分泌关系不明显。

在Cao等［21］的研究中，人肝癌细胞系HepG-2和BEL-7402肿瘤细胞的生长都被PA-MSHA抑制了，但不是被甘露糖钝化的PA-MSHA，PA-MSHA处理过的细胞停滞在细胞周期的S期并凋亡。作者假定HepG-2和BEL-7402肿瘤细胞的凋亡是由PA-MSHA的甘露糖残留物介导的，并直接通过caspase-8，外在凋亡途径引发。

免疫抗癌疗法必需的有效T细胞反应是由抗原呈递细胞启动的，多个研究评估了多种抗原呈递方式的有效性，包括细菌载体。理想的载体应包括低毒性和稳定的N端终止序列，可以把混合抗原转导入细胞，活的经过基因工程处理的铜绿假单胞菌用来运载重组的抗原蛋白通过Ⅲ型分泌系统进入哺乳类动物细胞内，即一个把效应蛋白转导入宿主细胞的细菌载体。在体外铜绿假单胞菌载体转导卵清蛋白片段到树突状细胞引起了卵清蛋白特异性的CD+T8细胞激活［22］，接受卵清蛋白注射的小鼠产生了卵清蛋白特异性CD8+T细胞，表现出对卵清蛋白过度表达黑素瘤的抵抗。还有在治疗效果检验中，于肿瘤模型建立5～12 d注射铜绿假单胞菌载体，6个实验动物有5个获得完全治愈。这些结果点燃了以Ⅲ型分泌系统为基础的载体在免疫疗法抗肿瘤应用中的希望。另有文献报道白细胞介素4与铜绿假单胞菌外毒素的融合毒素正在进行恶性胶质瘤患者的Ⅰ期临床实验。

3 存在问题

安全性问题仍然是细菌抗肿瘤疗法的首要问题，虽然大多数报道证实细菌制剂是安全的，但是控制活体细菌的毒性、减少不良反应还要进一步研究评估测试，另有报道［23］，细菌抗肿瘤研究中系统感染仍然存在，即使剔除毒性基因像在COBALT疗法中，仍有15%～45%的实验动物小鼠死亡;其次是不完全的肿瘤细胞死亡，细菌并不引起完全的肿瘤组织细胞坏死，必须联合应用化疗或进一步研究;第三是在坏死缺氧的肿瘤组织生长繁殖的细菌对无坏死的转移性肿瘤病灶作用效果不佳，而转移灶常常是因肿瘤致死的元凶，由于这些转移灶很小，细菌定植困难，细菌难以完全浸润肿瘤组织，因此可能需要肿瘤内注射［24］，其他的涉及细菌疗法的问题［25］还包括潜在的基因突变，因突变导致抗肿瘤功能丧失或导致多种问题如治疗失败、感染加重等。

4 结语

目前关于细菌抗癌的研究还处于实验研究阶段，其他的菌种如双歧杆菌、减毒李斯特菌等菌株和多种肿瘤细胞株，多种荷瘤实验动物模型也正在研究中，得出的结论多是肯定的，细菌可促进肿瘤细胞凋亡，部分研究的结论甚至是治愈恶性肿瘤，其结果是在体外细胞培养或实验动物(如荷瘤裸鼠)身上取得的，进一步的临床实验大多还没有开展，具体的生化免疫机制仍需要进一步探索。

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The Study of Antitumor Effects of Bacteria

YANG Xu-guang，YANG Zhi-qi，SUN Zhen-gang.(Department of Hepatobiliary Surgery，Jingzhou Clinical Medicine School Affiliated to Yangtze University，Jingzhou434020，China)

The resistance of malignant tumors to traditional antitumor therapies pushes the search for new and more effective antitumor therapies.Studies reveal that some types of bacteria can suppress tumor cell growth or kill tumor cells，and some other types have the ability of assembling in tumor tissue，thus can be used as vectors for antitumor drugs and genes;bacteria toxins also show antitumor effects，some types of bacteria have gone through phase Ⅰ clinical trials，while the relationship between bacteria，including pathogenic bacteria，and tumors still needs further medical study.

Antitumor;Salmonella typhi;Pseudomonas aeruginosa;Bacterial agent;Biotherapy

Q782;Q935

A

1006-2084(2012)13-2001-04

2012-02-22

2012-05-15 编辑：纪燕飞