转化生长因子β信号通路研究进展

秦庆华 姚咏明

转化生长因子β信号通路研究进展

秦庆华 姚咏明

转化生长因子－β(transforming growth factor－β，TGF－β)是生长因子超家族中具有免疫负调控功能的一大类细胞因子家族。现已知，几乎体内所有的细胞均可分泌TGF－β并对TGF－β产生反应［1］;但有证据表明，Foxp3+调节性T细胞(Foxp3+Treg)是TGF－β的主要来源［2］。TGF－β超家族成员可调节多种细胞功能，包括细胞生长、黏附、迁移、分化和凋亡，并在调节炎症反应、伤口愈合、免疫稳态及免疫耐受中发挥重要作用。TGF－β下游信号功能障碍参与了人类多种疾病的发病过程，如癌症、纤维化、伤口愈合异常，以及多种遗传性疾病，包括家族原发性肺动脉高压、遗传性出血性毛细血管扩张等［3］。此外，TGF－β信号通路在胚胎发育过程中具有重要作用［4］。在TGF－β家族成员中，TGF－β1是一种非常重要的细胞因子，它不仅能够抑制上皮细胞的生长，而且能够促进细胞的凋亡。本文拟就TGF－β相关信号通路研究进展进行综述。

一、TGF－β超家族成员

TGF－β最早由Roberts等［5］从小鼠的肉瘤细胞中分离得到，是由二硫键相连形成的一种同源二聚体多肽分子，分子质量25kDa。TGF－β超家族成员又分为多个家族:TGF－β、活化素(activin)、Nodal家族和骨形成蛋白(BMP)、生长分化因子(GDF)、缓勒氏管抑制物(MIS)家族等。TGF－β超家族成员在进化过程中结构和功能高度保守，调节多种细胞的生长、分化，在胚胎发育、组织器官形态发生、细胞分化、增殖以及免疫调控等方面都发挥重要作用。在哺乳动物中至少发现有TGF－β1、TGF－β2、TGF－β33种TGF亚型，其中TGF－β1在人血小板和哺乳动物骨骼中含量最高。TGF－β以二聚体蛋白的形式在细胞内合成后，首先与潜活相关肽(LAP)以非共价键结合形成小潜活TGF－β复合物(SLC)，然后SLC再与潜活TGF－β结合蛋白(LTBP)以二硫键结合形成大潜活复合物(LLC)［6］。TGF－β以无活性的LLC的形式被分泌到细胞外，无活性TGF－β必须经过额外的激活步骤，例如蛋白酶解，或者通过细胞表面一些特殊受体的结合才能活化［1］。

二、TGF－β受体的结构与功能

TGF－β家族受体分为3型(TβRⅠ、Ⅱ、Ⅲ)。Ⅰ、Ⅱ型受体(TβRⅠ、Ⅱ)系具有丝/苏氨酸激酶活性的Ⅰ型跨膜糖蛋白，一般由4部分构成:信号肽、亲水胞外区、跨膜区和胞内区。人类基因组编码5类TβRⅡ(TβRⅡ，ActR－Ⅱ，ActR－ⅡB，BMPR－Ⅱ，AMHR－Ⅱ)、7类TβRⅠ(activin receptor－like kinases 1－7，ALK1～7)［7］。这两型受体的核心多肽含有约500～570个氨基酸残基。亲水胞外区相对较短(约150个氨基酸残基)，胞外区近膜侧有约10个半胱氨酸残基组成的保守结构，称为“Cys盒(Cys box)”，可被TβRⅡ磷酸化。在TβRⅠ的胞内侧近膜部分有一高度保守的Ser－Gly－Ser－Gly－Ser－Gly序列(Gs结构域)，富含甘氨酸和丝氨酸;TβRⅡ胞质区的C端，即激酶区的远膜端为22个氨基酸组成的富含丝氨酸和苏氨酸的尾巴，可发生自身磷酸化。而TβRⅠ不能发生自身磷酸化，必须经TβRⅡ激酶磷酸化之后才有活性。TGF－β家族成员与相应受体结合的形式分两种:第一种结合形式的配体包括TGF－β和活化素(activin)，这种配体不能直接结合TβRⅠ，必须首先与TβRⅡ结合，然后配体－TβRⅡ复合物再与TβRⅠ结合;第二种结合形式的配体主要是BMP，TβRⅠ和TβRⅡ同时与配体结合。在大多数情况下，TβRⅡ和TβRⅠ并不直接接触，但通过与配体的结合之后能够紧密联系在一起。TGF－β在与受体结合后形成TβRⅠ－TGF－β－TβRⅡ异源四聚体，在TGF－β信号通路中将信号从胞膜外传入胞核过程中发挥重要作用。TβRⅢ主要是β－聚糖和内皮因子。虽然目前尚未发现通过TβRⅢ激活的细胞内信号通路，但TβRⅢ确实能起到清除活化的TGF－β的功能。TβRⅢ的功能与其存在形式有关，当TβRⅢ以溶解形式存在时，可作为抑制剂抑制TGF－β结合至TβRⅡ上;但当TβRⅢ结合到细胞膜表面时，它们又能协助TGF－β与TβRⅡ的结合［1］。由此推测，TβRⅢ可能在TGF－β信号途径的负反馈调节中发挥一定功能。另外，TβRⅢ还能抑制肿瘤细胞的转移、浸润、生长和血管的发生，显示出TβRⅢ在肿瘤治疗中的潜在应用价值［8］。

三、Smad的结构和功能

1．Smad分子的命名:1995年，Sekelsky等［9］在果蝇遗传学研究中发现了能补救Dpp分子基因dpp缺失突变的分子，命名为Mad(mothers against dpp)，并证实Mad蛋白参与了TGF－β的信号转导。不久在线虫克隆出Mad相关基因，因这些基因突变可导致躯体变小(small body size)，将其命名为Sma2、Sma3、Sma4。Sma是Mad的同源物，因此将他们统一命名成Smad蛋白家族。Smad蛋白一般由400～500个氨基酸残基构成，分子质量约为42kDa～60kDa。

2．Smad分子的分类:根据Smad蛋白结构和功能相似性，将其分为3类:①受体调控型Smad(receptor－regulated Smad，R－Smad)，包括Smad1、2、3、5、8。R－Smad分子C端具有特征性丝氨酸基序(SSXS motif)，可被活化的TβRⅠ磷酸化。该组Smad分子决定了配体信号转导的特异性;②共用型Smad(common Smad，Co－Smad)，Co－Smad在脊椎动物中只有Smad4，所有TGF－β超家族中的信号分子在进入细胞核之前，均需要与Smad4结合;③抑制型Smad(inhibitory smad，I－smad)，包括Smad6、7。I－smad可以与R－Smad竞争结合活化的TβRⅠ，从而在TGF－β家族成员的信号转导中发挥负调控效应。

3．Smad分子的结构与功能:R－Smad和Smad4包含两个高度保守的结构域:即位于N端的Mad同源区1(MH1)和C端的Mad同源区2(MH2)。MH1和MH2由一保守度稍低，富含脯氨酸的连接区分隔开来。除Smad2外，R－Smad和Smad4的MH1结构域都能直接与DNA结合。连接区存在丝裂原活化蛋白激酶(MAPKS)、糖原合成酶－3β(GSK－3β)、泛素连接酶Smurf的连接位点，因此推测连接区是TGF－β信号通路与其他信号通路发生交汇对话(crosstalk)以及对TGF－β信号通路进行反馈调节的关键部位［10］。而在I－Smad中，并无典型的MH1结构，这正是I－Smad发挥抑制作用的结构基础。位于Smad分子C端的MH2结构域有一特征性丝氨酸基序(SSXS motif)，可被TβRⅠ识别并磷酸化，介导了Smad分子与受体之间、Smad与Smad分子之间以及Smad分子与转录因子相互作用。

四、Smad分子介导的TGF－β信号转导

1．TGF－β信号转导的基本过程:TGF－β在细胞内以无活性的形式合成与分泌，无活性的TGF－β必须经过额外的刺激活化之后才能与TGF－β受体结合并表现出生物学活性。因为TβRⅠL45环(L45 Loop)和各R－Smad亚型L3环(L3 Loop)氨基酸序列的微小差异，TGF－β家族的信号通路可以分为明显不同的两条:TGF－β－活化素－nodal支(TGF－β－activin－nodal branch)，信号通过ALK4、ALK5、ALK7，激活下游的Smad2/3分子;骨形成蛋白－生长分化因子支(BMP－GDF－branch)，信号通过ALK1、ALK2、ALK3、ALK6激活下游的Smad1、Smad5和Smad8分子［11］。在TGF－β信号通路中，活化的TGF－β首先结合TβRⅡ，随后与TβRⅠ二聚体形成活化的信号复合物，TβRⅡ激酶区引起TβRⅠ－GS结构域磷酸化并活化。活化的TβRⅠ与胞质内以同源寡聚体存在的Smad2/3分子短暂结合，使Smad2/3分子C端的SSxS基序中两个丝氨酸残基磷酸化而激活，并与Smad4结合形成异源六聚体进入胞核，作为转录因子单独或与其他DNA结合蛋白共同激活特定靶基因的转录。完成转录之后，Smad复合物能够解离，磷酸化R－Smads被细胞核内的磷酸酶(例如PPM1A/PP2C)脱去磷酸基，使这些R－Smads分子重新回到细胞质中，形成一个“Smad循环”［12］。

2．TGF－β信号转导的调节

(1)TGF－β受体活化的调节:TGF－β受体活化过程中，磷酸化发挥了重要作用。TβRⅡ首先需要自身磷酸化其氨基酸残基中Ser213、Ser409才能被组成性激活，其后与TβRⅠ相互作用并激活TβRⅠ［13］。在与TGF－β反应之后，TβRⅠ也能发生酪氨酸残基的磷酸化［14］。除了磷酸化作用，胞质内的一些低分子蛋白质也对TGF－β受体活化具有重要调节效应。亲免蛋白FKBP12是一种对TGF－β信号通路起负调控作用的胞质蛋白，其发挥抑制作用的机制是FKBP12能够与TβRⅠ的GS结构域结合，覆盖了TβRⅡ磷酸化位点并能稳定无活性的TβRⅠ结构。FKBP12亦能以一种活化素依赖的方式与Smad7相互作用，在TβRⅠ上形成FKBP12－Smad7复合物，因此FK-BP12可作为Smad7－Smurf1复合物的衔接蛋白促进TβRⅠ的泛素化降解［15］。STRAP可与TGF－β受体以及Smads2、3、7相互作用，它通过稳定Smad7与受体的结合，干扰Smad2/3与TβRⅠ结合，或者通过募集受体磷酸酶，从而在TGF－β信号通路中发挥负调控作用［16］。有资料证实，携带FYVE结构域的SARA (Smad anchor for receptor activation)通过将Smad2/3转移给受体复合物，能够促进TGF－β信号转导［17］。SARA不仅可控制Smad2的亚细胞定位，还促进Smads2与TβRⅠ相互作用。热休克蛋白90通过与Ⅰ、Ⅱ型受体的相互作用也参与了对TGF－β受体活化的正向调节过程［18］。另据报道，PPP家族的磷酸酶亦参与了TGF－β受体活化的调控［19］。PPP家族成员结构中包含有催化亚基和高度可变的调节亚基，因此代表了几百种蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的活性。PPP家族成员中蛋白磷酸酶1(PP1c)是对Dpp信号通路产生负调控效应的调节因子。PP1c通过一特殊的基序结合到SARA上并定位于Dpp受体复合物，干扰PP1c与SARA的相互作用从而导致DppⅠ型受体的磷酸化水平增高。在TGF－β信号途径中，Smad7可与GADD34(growth arrest and DNA damage protein)相互作用，GADD34是人类PP1全酶的调节亚基。Smad7－GADD34复合物能募集PP1的催化亚基对TβRⅠ产生去磷酸化作用，在TGF－β信号通路中发挥负反馈作用［20］。Smad7介导的TβRⅠ去磷酸化作用是TGF－β信号通路有效的负反馈机制。

(2)R－Smad的调节:TβRⅠ对R－Smad分子C端SSXS基序的磷酸化是R－Smad分子活化的关键步骤，在细胞核中，主要通过两种机制调节R－Smad的功能:磷酸酶介导的去磷酸化作用以及泛素依赖的R－Smad降解。PPM1A/PP2Cα是Smad2/3 SSXS基序特异性磷酸酶。PPM1A过表达取消了TβRI组成性激活诱导的Smad2/3磷酸化作用，而shRNA介导的PPM1A沉默延长了Smad2/3 SSXS基序磷酸化的持续时间。而且，PPM1A结合到磷酸化Smad2/3上，协助去磷酸化Smad2/3从胞核转运至胞质［12］。最近，有资料证实，PTEN作为PPM1A的辅助因子参与了TGF－β信号通路的负反馈调节。PTEN主要通过与PPM1A形成一稳定的复合物，避免TGF－β诱导的PPM1A降解。因此，PTEN通过稳定PPM1A促进Smad2/3的去磷酸化效应。

除了磷酸酶，R－Smad还受到泛素－蛋白水解酶复合体通路(UPP)的调控。Smurf1，Smurf2以及相关的NEDD4－2都是E3泛素连接酶亚家族的成员，参与了TβRⅠ及R－Smad的泛素化和降解。爪蟾与人的Smurf1之间有91%的同源性，优先与Smad1、5连接区域的PPXY结构域结合，独立诱导Smad1、5的泛素化和降解。Smurf2可与Smad1、2结合，但不与Smad4结合，优先与核内磷酸化的Smad2结合并介导其降解。Smad3还能与Smurf2和NEDD4－2结合，但Smad3并不能够被这些HECT类的E3泛素连接酶降解。另有研究表明，Smurf2可下调Smad1、2表达水平，但不影响Smad3的表达。Smad2在核内的聚集最终导致其多聚泛素化以及随后被蛋白水解酶复合体所降解。Smurf2也可通过Smad7与TGF－β受体复合物结合，进而引起受体和Smad7的降解。Smad2－Smurf2复合物还能诱导SnoN的降解，该过程受到后期促进因子(anaphase－promoting complex，APC)和UbcH5泛素偶联酶(E2)的介导。

(3)I－Smad对TGF－β信号通路的调节:ISmad包括Smad6、7，其结构不同于R－Smad和Co－Smad，它们具有独特的MH1结构域，并且缺乏C末端的磷酸化位点。Smad6、7是TGF－β/BMP信号通路负反馈环的关键调节因子。它们能通过竞争性抑制，与TβRⅠ形成稳定的复合物，抑制R－Smad的磷酸化;或者通过募集E3泛素连接酶(Smurf1/2)，造成TβRⅠ的泛素化降解。另外，Smad6、7能与转录抑制因子相互作用，或干扰R－Smad－DNA复合物的形成，从而在细胞核内抑制TGF－β/BMP信号转导。

五、TGF－β信号转导的非Smad途径

除了经典的TGF－β/Smad信号通路，TGF－β还能以非Smad信号途径的方式激活MAPK信号通路、Rho样GTPase信号通路和PI3K/Akt信号通路。

在受体酪氨酸激酶(RTK)/Ras/胞外信号调节激酶(ERK)信号转导中，TGF－β与RTK结合可诱导RTK的二聚体化并激活，进一步引起RTK胞质部分的多个酪氨酸残基磷酸化。这些磷酸化的酪氨酸残基能够作为具有SH2或PTB结构域的信号分子(例如Src和Grb2)的结合位点。Grb2作为衔接蛋白，在没有配体刺激的情况下在胞质中与Sos结合。RTK活化后，Grb2/Sos复合物经由Grb2的SH2结构域或通过另外一个衔接蛋白Shc，与RTK的酪氨酸残基作用，Sos催化GDP生成GTP活化了Ras，活化的Ras与Raf结合，从而激活包括MEK和ERK在内的MAPK级联反应。TGF－β除了通过RTK/Ras/ERK激活MAPK信号途径，还可经由TRAF6－TAK1－ JNK/p38激活MAPK信号转导过程。MAPK活化后再激活一系列蛋白分子(主要是细胞核内的转录因子)，对细胞的生存、分化、增殖及凋亡等方面发挥重要调控作用。此外，TGF－β通过Par6－Smurf1－RhoA激活Rho样GTPase信号通路，或通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路，在上皮向间质过度、成纤维细胞增殖以及形态改变等方面发挥一定作用。

六、TGF－β信号通路和其他信号途径之间的交汇对话

TGF－β信号通路虽然简单，但对生物体多种生命过程的调节却是必不可少的。除了经典的TGF－β/Smad信号通路之外，TGF－β还能以细胞类型依赖的方式与其他的信号途径(例如MAPKs，PI3K/ Akt，RhoA/Cdc42等)产生交汇对话，使TGF－β信号转导更具有复杂性、多样性和可调控性。

1．TGF－β信号通路与MAPK通路之间的交汇对话:研究证实，Smad蛋白的连接区是RTK/MAPK信号通路与TGF－β信号通路发生整合的关键平台。Smad蛋白的连接区结构上连接松散，并高度可变，使它很容易与各种蛋白激酶接近。该连接区富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基，并能优先地被脯氨酸定向的蛋白激酶(例如MAPKs和GSK3－β)磷酸化。最近发现Smad3连接区的3个氨基酸残基(Thr178，Ser203和Ser207)是ERK1/2磷酸化的位点，ERK介导这些位点的磷酸化抑制了Smad3的转录活性，但对Smad3进入细胞核却并没有影响。GSK3－β结构与MAPKs相似，能选择性地磷酸化Smad3连接区的Ser203。GSK3－β对Smad3连接区的磷酸化似乎并不影响Smad3的定位或活性，GSK3－β在TGF－β信号转导过程中的作用还有待证实。MAPKs(尤其是ERK1/2)可磷酸化Smad1/5的连接区，几乎完全阻断Smad1/5的核转位。Smad1/5连接区的多个丝氨酸/苏氨酸残基被ERK和GSK3－β磷酸化，形成Smad1/5特异性E3泛素连接酶Smurf1的锚定位点。Smurf1与Smad1/5连接不仅诱导Smad1/5的泛素化降解，还封闭了它们与核孔复合体的相互作用，因此阻止Smad1/5的核转录［10］。MAPKs对Smad2/3和Smad1/5作用的差异可能缘于它们的连接区氨基酸序列不同所致。

2．TGF－β信号通路与PI3K/Akt信号通路的交汇对话:PI3K/Akt信号转导可抑制TGF－β介导细胞凋亡和细胞周期停滞，有趣的是，Smad3而非Smad2才是PI3K/Akt抑制的主要对象。PI3K/Akt对Smad3的抑制反应主要通过3种机制:①PI3K/Akt经TGF－β受体调节Smad3的活化;②PI3K活化后通过锚定在质膜上的Akt“扣留”Smad3，从而阻断Smad3的核转位;③PI3K/Akt通过下调Smad3发挥功能所必须的核因子发挥对Smad3的抑制功能。值得注意的是，PI3K/Akt信号转导过程亦受到TGF－β的调节。例如，TGF－β活化时使Akt活性增加，从而使TGF－β信号通路与PI3K/Akt信号途径之间的交汇对话更具有双向性。

七、展望

业已明确，TGF－β是调节各种细胞生理过程的重要细胞因子，参与了诸如细胞增殖、分化、凋亡、黏附和迁移等多方面功能的调节。TGF－β信号通路在不同水平受到精密的调控，其调节功能障碍与人类多种疾病的发生密切相关。Smad蛋白作为TGF－β信号转导中关键的信号分子，对维持细胞的正常功能发挥重要作用。除了Smad蛋白，TGF－β信号途径还以非Smad蛋白的方式参与细胞功能的调节。另外，TGF－β信号通路还与其他的信号途径之间存在交汇对话，使TGF－β信号通路更具有复杂性、多样性和可调控性。由于TGF－β具有广泛的生理作用与病理效应，因此深入了解其确切信号转导环节、Smad蛋白功能以及与其他信号通路间的相互作用，进而精确控制TGF－β的功能，这对于实现在分子水平干预人类多种疾病的目的具有重要意义。

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(收稿:2012－02－22)

国家自然科学基金资助项目(30971192，81130035，81071545);国家重点基础研究发展计划基金项目资助(2012CB518102)

100048北京，解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所(秦庆华、姚咏明);510515广州，南方医科大学基础医学院(秦庆华)

姚咏明，教授，博士生导师，电子信箱:c_ff@sina．com