Toll样受体及其与牙周疾病的关系

魏玲玲，侯 萌，王 萍 综述;宋 晖 审校

(山东大学口腔医学院初诊科，山东济南250000)

固有免疫系统在机体防御中具有重要意义，可视为宿主抵御致病微生物的第一道防线。固有免疫系统一方面可以通过急性炎症反应等直接清除感染;另一方面还可诱导获得性免疫系统的活化，进而激发更加高效和特异性的免疫反应。固有免疫系统依靠模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)来识别细菌、病毒等外来微生物。Toll样受体 (Toll like receptors，TLRs)是固有免疫系统中的病原模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRR)，能识别大量微生物表面的高度保守结构并通过细胞间信号通路活化固有免疫细胞，从而激发获得性免疫应答［1］。牙龈上皮细胞持续地暴露于至少500种口腔共生菌和致病菌中［2］，牙周组织为口腔微生物与免疫系统的持续性接触提供了独特的环境。牙周炎是一种慢性细菌感染性疾病，是由菌斑刺激导致的宿主免疫炎性反应从而引起的牙周支持组织破坏。这就提示TLR可能在牙周生理和病理过程中发挥着重要作用，本文就其与牙周病的相关性研究作一综述。

1 TLR及其信号通路

1.1 TLRs及其结构特点

TLRs是一类广泛存在于哺乳动物细胞内的生物模式识别受体，能够识别大量微生物表面的高度保守结构，如细菌脂多糖、肽聚糖、脂蛋白、细菌DNA、双链RNA等，这些结构被称作病原体相关分子模式 (pathogen associated molecular pattern，PAMP)。Anderson KV等(1985)首次发现了Toll基因产物即跨膜蛋白Toll蛋白，并认为其在果蝇胚胎背腹侧的发育中起关键作用，且能调节果蝇因真菌感染所致的免疫反应［3］。由于与果蝇Toll的同源性，后将哺乳动物的该蛋白称作Toll-like受体(Toll-like recepters，TLRs)［4］。迄今为止，共发现10种人类跨膜蛋白基因属于TLR家族。

TLRs具有高度保守的结构域特征，属Ⅰ型跨膜受体，由细胞外区、跨膜区和细胞内区3个功能区组成。其胞外区含有19～25个亮氨酸重复序列，是配体结合的特异部位，主要功能是促进蛋白质间的相互粘附。人类所知10种TLRs的胞外富含亮氨酸的重复基序能针对标识不同微生物感染的特异性PAPM发生反应。该相对限制部位决定了其识别PAPM的专一性，但某些特定的PAPM通常需要多个TLR联合识别。例如:TLR4主要介导G-菌的内毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的信号转导;TLR5能够识别细菌的鞭毛蛋白;而TLR2可与TLR1或TLR6形成异源二聚体，识别多种病原结构，包括细菌的脂蛋白和其他胞壁结构［5］。

1.2 TLRs信号传导通路

在与配体结合后，TLRs的结构发生二聚化，由此激发TOLL/IL-1受体结构域结构区(Toll-IL-1 receptor domain，TIR)与胞内衔接分子的相互作用从而激活信号传导，引起致炎细胞因子的释放，激发固有免疫应答。TLRs信号传导级联反应包括髓样分化因子88(Myeloid differentiation primary-response protein 88，MyD88)依赖型以及MyD88非依赖型通路。

MyD88依赖型TLRs信号通路活化IL-1受体相关激酶，而后联合肿瘤坏死因子受体相关因子6 (tumor-necrosis-factor receptor-associated factor 6，TRAF6)激活两条不同的信号传导途径。其中之一是通过活化丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)激活活化蛋白-1，并通过中介蛋白ECSIT将TRAF6与MAPK通路联系起来，激活JNK、p38等通路。另一条则是通过激活转化生长因子β活化激酶/转化生长因子β活化激酶结合蛋白-1复合体，从而上调核因子κB抑制蛋白激酶复合物(inhibitor of nuclear factor-κB kinase complex，IKK)的活性。一旦IKK被激活，其发生磷酸化并导致核因子κB抑制蛋白(IκB)的降解及核因子κB(nuclear facto κ，NF-κB)的释放。随之NF-κB转移至核内，转录调节细胞因子和趋化因子的释放，诱导炎症反应和启动固有免疫。

尽管大多数TLRs调节反应基于MyD88依赖型通路，但TLR3和TLR4却是通过MyD88非依赖通路活化干扰素调节因子-3(interferon(IFN)-regulatory factor-3，IRF-3)诱导IFN-1的表达［6］。研究表明:LPS作用于MyD88基因缺陷小鼠，仍然可以诱导该鼠NF-κB和JNK的激活，提示存在一种MyD88非依赖性信号传导途径就能够介导LPS的作用产生炎症因子。目前研究表明:具体的TLR所调节的信号通路能特异地选择接头分子以激活MyD88依赖性或MyD非依赖性途径。

2 TLRs在正常牙周组织中的作用

2.1 TLRs在正常牙周组织中的表达

TLRs主要表达于包括中性粒细胞、单核巨噬细胞和树突状细胞在内的固有免疫系统细胞。作为血液系统最主要的固有免疫细胞，中性粒细胞能在第一时间转移至感染部位，依赖相关的TLRs识别各种微生物的入侵并产生免疫应答。中性粒细胞表达除TLR3以外的所有TLRs［7］。单核巨噬细胞表达TLR1、TLR2以及TLR4-8，PAMP与单核细胞的结合能够影响适应性免疫反应的类型［8］。树突状细胞表达多种TLRs，TLRs通过与病原体的相互作用激活树突状细胞，由此诱导对T细胞增殖及分化具有重要意义的大量共刺激分子的表达以及细胞因子和趋化因子的产生［9］。

牙周组织是包括牙龈、牙骨质、牙周膜以及牙槽骨的牙齿支持结构。组织学检测显示:在龈沟液及牙龈上皮细胞层存在少量免疫细胞，包括巨噬细胞、朗格汉斯细胞、树突状细胞以及中性粒细胞。现已明确:在牙周疾病组织中能检测到T淋巴细胞和B淋巴细胞游出［9］。目前已发现作为适应性免疫应答细胞，T、B淋巴细胞均表达TLRs。牙龈卟啉单胞菌LPS可直接刺激B1细胞产生IL-10，产生免疫应答。T细胞表面TLRs与其配体的结合能直接调节T细胞的功能，促进其增殖和细胞因子的产生，而CD25+CD4+调节性T细胞表面TLRs的活化能调节其抑制活性［10］。

牙龈上皮能够保护其下的牙周组织免受口腔致病微生物和其他有害因子的影响，在保持牙周内稳态方面起着重要作用。通过对人牙龈活体组织上皮细胞TLRs表达的检测，发现牙龈上皮细胞表达TLR2-6以及TLR9［11］。牙龈成纤维细胞表达TLR1-9mRNA和其他TLRs相关分子，例如CD14 (一种脂多糖的共受体)、MyD88、NOD1［12］。比较来自同一志愿者的牙龈成纤维细胞与牙周膜成纤维细胞，后者较前者表达更高水平的TLR2以及更低水平的CD14［13］。这种差异性提示两种细胞在对菌斑细菌反应上可能具有一定的功能差异。成骨细胞是骨形成细胞，且对调节破骨细胞的活化与分化方面有着重要作用。Nemoto E等的研究表明:鼠成骨细胞及破骨细胞均表达TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9、MD-2、CD14、NOD-1、NOD-2［14］。来自鼠骨髓的破骨细胞能够表达 TLR2、TLR4以及CD14的mRNA［15］。人微血管上皮细胞通常被认作是一种相对惰性的血管内皮细胞，但现已明确其在调节免疫和炎症反应中发挥着积极的作用。而牙周膜正是一种包绕于牙根表面的高度血管化组织。这些细胞表达TLR1、TLR4、TLR5的mRNA，但不表达或少量表达TLR2 mRNA［16］。

2.2 TLR在维持牙周健康中的作用

研究已表明牙周组织细胞表达多种不同类型的TLRs，活跃参与了抗菌斑细菌的固有免疫应答和适应性免疫的活化和调节。牙龈上皮细胞虽持续地暴露于至少500种口腔共生菌和致病菌中［2］，但却能够通过TLRs信号通路调节其反应以维持自身稳态。近来一些学者提出:长期暴露于细菌产物后的口腔黏膜。下调TLRs的表达并限制细胞间的信号传导，从而使其耐受性增强，但该推测已遭到质疑。目前有研究证实:在稳定状态下共生菌对TLRs的激活对维持口腔稳态并保护其免受损伤至关重要。在稳定环境下牙龈上皮(特别是龈牙结合区)表达的TLRs与牙表面菌斑细菌产物持续作用，该TLRs信号通路引起固有免疫反应导致抗菌肽(β防御素，抗菌肽，钙防卫蛋白)和中性粒细胞趋化因子IL-8的释放［17］。由此认为，TLRs信号通路能抑制致病性感染并阻碍共生微生物穿透上皮屏障从而维持了牙龈健康。对牙龈上皮细胞和中性粒细胞及其在稳态下应对口腔菌斑细菌反应的交互作用更为深入的研究，能很大程度上加深对牙周膜如何通过TLRs信号通路激活固有免疫反应而不表露炎症状态这一问题的认识。

3 TLRs在牙周疾病中的作用

3.1 TLRs在单纯性牙周疾病中的作用

牙周炎是由菌斑微生物所引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，可引起牙周袋的形成、进行性附着丧失和牙槽骨吸收，最终导致牙齿脱落。高水平致病菌及其毒性产物侵袭后龈牙结合部上皮屏障的破坏是菌斑诱导型牙周炎发生的可能开端。在牙周组织中，PAMP对TLRs的慢性刺激能够引起大量前致炎因子、调节分子的产生并导致组织破坏。

Sun Y等(2010)发现:中国人慢性牙周炎患者牙龈组织和龈沟液中TLR2、TLR4、CSF2、LY64的mRNA以及蛋白表达量均高于健康人［18］。Scheres等(2011)亦证实，牙周炎患者牙周膜成纤维细胞中TLR1、TLR4、TLR7和CD14的表达水平高于健康人，而且牙周炎患者的牙周膜和牙龈成纤维细胞对牙龈卟啉单胞菌的刺激较健康者表现出更高的活性。用牙龈卟啉单胞菌LPS在体外刺激人牙龈成纤维细胞，能使其表达更高水平的TLR1、TLR2、TLR7［19］。前致炎因子 IFN-γ亦能上调人牙龈成纤维细胞TLR2 mRNA和蛋白的表达［20］。用肠道沙门氏菌和伴放线放线杆菌 A的 LPS刺激经IFN-γ预处理过的CD14高表达的牙龈成纤维细胞，能通过增强的TLR-4通路诱导细胞产生更多IL-8［21］。牙龈卟啉单胞菌LPS和IFN-γ能够增强TLR2、TLR4、CD14、MD-2的表达，这表明TLR通路在放大牙周结缔组织炎症反应中可能具有重要作用。

牙周炎患者的牙骨质会受到菌斑生物膜中G-病原菌的入侵。Nemoto E等(2000)的研究表明:在脂质A(TLR4配体)、CpG DNA(TLR9配体)或Pam3CSK4(TLR-1/2配体)刺激下，鼠成牙骨质细胞的NF-κB通路途径被激活，从而导致IL-6的产生［14］。牙槽骨再生为破骨细胞和成骨细胞两者的平衡所调节。细菌产物和宿主调节因子(IL-1，TNF-a，前列腺素E2等)通过抑制成骨细胞的生成及其活性，诱导破骨细胞激活而导致骨的吸收。牙龈卟啉单胞菌LPS能上调骨桥素(OPN)与骨保护素(OPG)但下调NF-κB受体活化因子配体(RANKL)的表达。该反应能被TLR4/MD-2抗体所阻断，这表明TLR4信号通路在其中的作用［22］。TLR4和TLR9信号通路均能刺激鼠成骨细胞产生TNF-α，这亦提示需进行更多研究以探明TLR在骨重建过程中的作用。

牙周膜是包绕牙根表面的高度血管化组织。有研究表明:TLR4能激活血管内皮产生大量前致炎因子和趋化因子［23-24］。TLR4配体，LPS以及前致炎因子诸如IFN-γ及TNF-α均能上调人内皮细胞TLR2的表达［25］。LPS和IFN-γ亦能上调内皮细胞TLR4 mRNA的表达［26］。

3.2 TLRs在伴有全身性病的牙周病中的作用

致病微生物是引发牙周病的始动因素。但全身因素亦可以改变宿主对局部因素的反应，影响并调控疾病的发生和发展。反之，牙周病局部病变所产生的致炎因子等又是全身性病的重要加重因素。

大量证据表明:糖尿病能够增加牙周病的风险并加速其发展进程。而慢性炎症或感染似乎能增强胰岛素抵抗，并由此促进糖尿病及其并发症的形成。Rojo-Botello NR等(2012)的研究表明:牙周炎患者牙龈组织中TLR2、3、4、9的水平高于健康对照组;而伴有糖尿病的牙周炎患者结缔组织中TLR2，TLR9、上皮区TLR4表达量明显高于不伴有糖尿病的牙周炎患者［27］。人们普遍认为适量的脂肪酸能够通过TLR4通路促使炎症的发生发展，而该炎症状态能够增强胰岛素抵抗。Watanabe K等(2011)发现，高糖饲养的患有牙周炎并TLR4功能缺失(loss-of-function，LOF)的小鼠较野生型小鼠表现出更强的葡萄糖耐受性和更低水平的肝内TNF-α mRNA和下颌骨骨丧失，提示牙周炎可能通过TLR4调节胰岛素分泌;而TLR4的功能缺失或许能维持肝脏对胰岛素的敏感性和增强葡萄糖的体内平衡［28］。

研究表明:吸烟者较不吸烟者易患牙周炎且更易发展为重症牙周炎及难治性牙周炎［29］。但吸烟者对牙菌斑刺激却表现出相对轻微的临床炎症，如水肿和探诊出血均较轻［30-31］。Juhi Bagaitkar等(2010)研究表明:牙龈卟啉单胞菌能通过改变自身多组基因及上调外膜蛋白(FimA)适应烟草萃取液造成的压力环境［32］，并抑制I-κBα的降解，降低TLR2的敏感性而使致炎因子的产生减少［33］。

不仅有论据支持牙周病与某些全身性疾病存在相关性，而且伴有全身疾病的牙周炎患者的TLRs、致炎因子及细胞因子均较不伴有全身疾病的牙周炎者和健康者高，提示TLR在上述全身性病与牙周病双向影响中可能有一定的作用。未来需做更多研究以探明牙周病与全身性病相互影响的可能机制。

4 小结

综上所述，由于牙龈上皮细胞持续地暴露于大量口腔共生菌和致病菌中，使TLRs信号通路激活而激发了固有免疫反应，能够促进抗菌肽及中性粒细胞趋化因子IL-8的释放，抑制致病性感染并阻碍共生微生物穿透上皮屏障，从而维持了牙龈健康。另一方面，高水平的致病菌及其毒性产物侵袭后龈牙结合部上皮屏障被破坏，使得细菌成分能够通过TLRs信号通路激活上皮下层和结缔组织中的其他细胞，诸如抗原呈递细胞(朗格汉斯细胞，间质性DC)、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞以及破骨细胞等。这些被激活的细胞能产生一系列的细胞因子、趋化因子及其他调节分子，进一步促进了炎症反应和免疫细胞的游出。游出的记忆性T细胞能够产生更多的细胞因子，以放大炎性反应并导致结缔组织和骨组织的破坏。因此牙周膜如何在炎性反应中维持自身稳态和避免自身破坏是颇值深思的问题。TLR在固有免疫系统中的作用的深入探讨必将会为牙周炎这一感染性疾病的发生和发展研究提供新的视角。

另外，牙周炎是极其复杂且多因素参与的疾病，其与许多全身性病具有双向影响。伴有全身疾病的牙周炎患者的TLRs、致炎因子及细胞因子均高于不伴有全身性病牙周炎者和健康者，可能为全身性病与牙周病双向影响机制提供了切入点与可能依据。

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