青蒿琥酯诱导食管癌Eca109细胞凋亡

刘 亮，左 静，左连富*，郭建文

(河北医科大学第四医院1.肿瘤研究所流式细胞室，河北石家庄050011;2.肿瘤内科，河北石家庄050011)

食管癌是我国较常见的恶性肿瘤，尤其是河北省的磁县，食管癌发病率及死亡率较高。抗肿瘤药物较大的不良反应是导致化疗效果下降的主要原因之一，寻找高效低毒的抗肿瘤药物，是肿瘤学研究者长期从事的工作。中药治疗肿瘤已具有几千年的历史，具有低毒、价廉等优点。青蒿琥酯 (Artesunate，Art)化学名为二氢青蒿素-1，2-α-2琥珀酸单酯，是具有倍半萜结构的抗疟药青蒿素的衍生物之一，研究发现，青蒿琥酯除了具有抗疟作用以外还具有抗肿瘤活性［1－2］，但在食管癌中的研究较少。本实验主要研究青蒿琥酯诱导食管癌细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系来源:人食管癌细胞系Eca109细胞为本实验室传代培养。

1.1.2 主要实验仪器及试剂:Epics-XLⅡ型流式细胞仪 (Beckman-Coulter公司);BCL-2抗体(克隆号:sc-7480)及BAX抗体(克隆号:sc-7382)(Santa Cruz公司);青蒿琥酯(批号:ZA070802)(桂林南药有限公司);胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 药物干预实验:取对数生长期的Eca109细胞以1×106/mL接种至细胞培养瓶中，待细胞贴壁后，加入不同浓度的青蒿琥酯，使终浓度分别达到10、20、40 mg/L，对照组使用0.9%氯化钠代替青蒿琥酯，作用24 h后，收集细胞，PBS液洗涤2次，部分细胞70%乙醇固定放入4℃冰箱保存用于流式细胞术检测，部分细胞用于Western blot检测。每组实验重复3次。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期:调整每份样品的细胞数为1×106/100μL，加入50 mg/L PI染液1 mL，在4℃冰箱中染色30 min，上机检测DNA含量。应用Expo 32 ADC软件对凋亡

1.2.3 流式细胞术检测细胞中BCL-2及BAX蛋白表达量:调整每份样品的细胞数为1×106/100μL，分别加入小鼠抗人BCL-2及BAX抗体，常温放置30 min，PBS液洗涤2次，加入1∶50稀释的羊抗小鼠FITC标记的IgG二抗，常温下放置30 min，PBS液洗涤2次，上流式细胞仪检测。流式细胞术检测蛋白含量以平均荧光强度表示。

1.2.4 Western blot方法检测细胞中BCL-2及BAX蛋白表达水平:冷PBS洗涤细胞2次，使用RIPA试剂常规方法提取细胞蛋白。常规Western blot方法检测细胞中BCL-2及BAX蛋白，其中β-actin为内参照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期

10、20、40 mg/L青蒿琥酯作用 Eca109细胞24 h后，与对照组相比，细胞凋亡率显著增高(p＜0.05)，细胞增殖指数显著降低(p＜0.05)，细胞G0/G1期显著增高(p＜0.05)，且具有剂量依赖性(表1，图 1，2)。

2.2 流式细胞术检测细胞中BCL-2及BAX蛋白表达水平

表1 流式细胞术检测不同浓度Art作用Eca109细胞24 h细胞凋亡率及细胞周期Table 1 The cell apoptosis rate and cell cycle of Eca109 cells after the treatment of different concentrations of Art for 24 hours assayed by flow cytometry，n=3)

表1 流式细胞术检测不同浓度Art作用Eca109细胞24 h细胞凋亡率及细胞周期Table 1 The cell apoptosis rate and cell cycle of Eca109 cells after the treatment of different concentrations of Art for 24 hours assayed by flow cytometry，n=3)

*p＜0.05 compared with Art 40 mg/L group

Art(mg/L)apoptosis rate(%)G0/1 phase(%)PI(%)0 1.52±0.09* 44.53±0.51* 55.46±0.51*10 5.26±0.20* 50.90±1.51* 49.10±1.51*20 18.39±1.58* 56.53±1.58* 43.47±1.58*40 26.78±1.09 61.60±2.44 38.40±2.44

青蒿琥酯组与对照组相比，细胞中BCL-2蛋白表达水平显著降低(p＜0.05)，细胞中BAX蛋白表达水平显著增高(p＜0.05)，且具有剂量依赖性(表2，图3，4)。

2.3 Western blot方法检测细胞中BCL-2及BAX蛋白表达水平

青蒿琥酯实验组与对照组相比，Eca109细胞中BCL-2蛋白表达水平降低，BAX蛋白表达水平增高(图5)，与流式细胞术检测结果一致。

表2 流式细胞术检测不同浓度Art作用Eca109细胞24 h细胞中BCL-2和BAX蛋白表达水平Table 2 The BCL-2 and BAX protein expression level of Eca109 cells after the treatment of different concentrations of Art for 24 hours assayed by flow cytometry(，n=3)

表2 流式细胞术检测不同浓度Art作用Eca109细胞24 h细胞中BCL-2和BAX蛋白表达水平Table 2 The BCL-2 and BAX protein expression level of Eca109 cells after the treatment of different concentrations of Art for 24 hours assayed by flow cytometry(，n=3)

*P ＜0.05 compared with Art 40 mg/L group．

Art(mg/L)BCL-2 protein BAX protein 0 420.28±6.04* 248.95±5.47*10 369.99±16.22* 292.65±9.47*20 322.34±14.11* 422.23±7.46*40 179.01±10.35 479.22±8.33

2.4 青蒿琥酯作用后Eca109细胞中BCL-2及BAX蛋白表达相关性分析

青蒿琥酯作用后，Eca109细胞中BCL-2及BAX蛋白表达呈显著负相关(pearson相关系数=－0.922，P=0.000)。

图3 流式细胞术检测不同浓度Art作用Eca109细胞24h细胞中BCL-2蛋白表达水平Fig 3 The BCL-2 protein expression level of Eca109 cells after the treatment of different concentrations of Art for 24 hours assayed by flow cytometry

图4 流式细胞术检测不同浓度Art作用Eca109细胞24h细胞中BAX蛋白表达水平Fig 4 The BAX protein expression level of Eca109 cells after the treatment of different concentrations of Art for 24 hours assayed by flow cytometry

图5 Western blot方法检测Eca109细胞中BCL-2及BAX蛋白表达水平Fig 5 The BCL-2 and BAX protein expression of Eca109 cells assayed by Western blot

3 讨论

食管癌是我国较常见的恶性肿瘤，目前食管癌的化疗效果欠佳，主要原因在于药物不良反应较大和多药耐药的产生，寻找低毒、不耐药的抗肿瘤药物就显得十分重要。中药治疗肿瘤已有久远的历史，具有不良反应少，价格低等优点。青蒿琥酯是青蒿素衍生物之一，具有较好的抗疟作用［3－4］，尤其对重型和耐药型疟疾具有较好的疗效［5－7］，进一步研究发现，青蒿琥酯还具有调节免疫、抗血吸虫及抗肿瘤作用［8－9］。本实验主要研究青蒿琥酯诱导食管癌细胞凋亡作用，为临床上寻找高效、低毒的抗食管癌药物提供实验基础。

大量文献报道，青蒿琥酯抗肿瘤主要是通过诱导细胞凋亡而发挥作用［10－11］，但少见在食管癌中的研究，在本实验中选取了青蒿琥酯的3个浓度，发现青蒿琥酯可以诱导食管癌Eca109细胞产生凋亡，而起到抗食管癌作用，且诱导细胞凋亡作用具有青蒿琥酯剂量依赖性。进一步研究发现，青蒿琥酯作用后抗凋亡基因蛋白BCL-2表达水平显著降低，而BAX蛋白表达水平显著升高，其两者之间具有显著的负相关性。降低细胞中BCL-2蛋白表达水平，升高BAX蛋白表达水平可以诱导细胞凋亡。本研究除了发现青蒿琥酯通过诱导细胞凋亡而起到抗食管癌作用外，实验中还发现，青蒿琥酯可以显著降低Eca109细胞增殖指数，抑制食管癌细胞增殖，将其细胞周期阻滞在G0/G1期。

综合本实验研究，提示青蒿琥酯具有抗食管癌作用。青蒿琥酯抗食管癌作用与诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞及抑制细胞增殖有关。青蒿琥酯具有低毒、高效及价廉等优点，如果能将其开发为抗肿瘤药物，将具有广泛的应用前景。

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