肠道病毒71型河南分离株2株全基因组序列分析*

冷 弘，卢 欣，刘慧涛，马云云，王媛媛，马 晶，郭茂峰，李 敏，赵国强#

1)洛阳职业技术学院免疫学与病原生物学教研室 洛阳 471000 2)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室 郑州 450001 3)南阳油田总医院消化肾病科南阳 473132 4)河南省职工医学院微生物学与免疫学教研室郑州 451191

#通讯作者，男，1965年10月生，教授，研究方向:肿瘤病因学，E-mail:zhaogq@zzu.edu.cn

肠道病毒71型河南分离株2株全基因组序列分析*

冷 弘1)，卢 欣2)，刘慧涛3)，马云云4)，王媛媛2)，马 晶2)，郭茂峰2)，李 敏2)，赵国强2)#

1)洛阳职业技术学院免疫学与病原生物学教研室 洛阳 471000 2)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室 郑州 450001 3)南阳油田总医院消化肾病科南阳 473132 4)河南省职工医学院微生物学与免疫学教研室郑州 451191

#通讯作者，男，1965年10月生，教授，研究方向:肿瘤病因学，E-mail:zhaogq@zzu.edu.cn

肠道病毒71型;手足口病;同源性分析;河南

目的:了解2011年河南洛阳和南阳地区流行的肠道病毒71型(EV71)基因特征。方法:分离洛阳和南阳地区EV71病毒各一株，分别进行全基因测序和基因进化分析。结果:EV71/Luoyang2011和EV71/Nanyang2011的VP1区序列在进化树上均属于C4亚型，与国内流行株都具有较高同源性，与2008年广东流行株亲缘关系最近。这2株全基因核苷酸序列同源性为99.3%，氨基酸序列同源性为97.6%，并且氨基酸均没有发生明显改变。结论: EV71/Luoyang2011和EV71/Nanyang2011属于C4亚型，与我省及我国既往流行株相比，未发生大的变异。

手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是由肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)［1-2］、柯萨奇病毒(Coxsackievirus A16，CoxA16)［3］等多种肠道病毒引起的常见传染病，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征，重症患者可表现为无菌性脑膜炎、脑炎等多种与神经系统相关的疾病［4］，多在婴幼儿中流行，致残和病死率均较高。近年来，世界各国包括亚太地区EV71流行日趋严重，呈逐年上升趋势［5-8］，严重程度日趋增强［9-10］。我国于2008年5月将HFMD列为丙类传染病。为了深入了解2011年河南省流行的EV71基因特征和积累分子流行病学数据，作者对2株EV71河南分离株进行了全基因序列测定和进化途径分析，报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 病毒RNA提取试剂盒购自美国Qiagen公司;RNA PCR(AMV)试剂盒、DNA Marker购自大连宝生物工程有限公司;pGEM-T Easy Vector Systems购自美国Promega公司;凝胶成像系统购自美国ABI公司。

1.2 EV71河南分离株的来源 选取2011年4月河南省洛阳市和南阳市、经临床确诊为HFMD的患儿各1例，分别为1岁男婴和2岁女幼儿，合并重症心肌炎或肺炎。采集患儿咽拭子、粪便、疱疹液标本，按WTO肠道病毒分离操作规程接种Vero细胞分离培养，待产生细胞病变后，采用微量中和试验和RT-PCR方法鉴定，均为 EV71型，分别命名为EV71/Luoyang2011和EV71/Nanyang2011。

1.3 病毒cDNA的扩增 将患儿疱疹液接种Vero细胞，当发生明显细胞病变后，采用Qiagen公司的病毒RNA提取试剂盒，从细胞培养上清液中提取RNA，分别用通用引物六聚体为引物，在AMV作用下逆转录后得到2个分离株的cDNA;以此为模板，在设计的覆盖全基因组的8对引物(表1)作用下进行PCR，产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 EV71分段扩增引物

1.4 扩增片段的克隆和测序 使用Qiagen公司的DNA胶提取试剂盒回收 PCR产物;10×Buffer 1 μL，pGEM-T Easy Vector 1 μL，T4连接酶1 μL，胶回收DNA片段7 μL，室温连接30 min，常规法转化入感受态细菌DH5α;选择白色转化菌，培养后用Qiagen公司小量质粒提取试剂盒提取重组质粒，送上海生工生物工程有限公司以T7和SP6为通用引物进行测序。

1.5 病毒基因组序列分析 采用DNASTAR和DNASIS进行核苷酸及氨基酸序列同源性分析，利用Lasergene的MegAlign构建进化树。

2 结果

2.1 全基因组扩增结果 8对引物扩增后均得到预计大小片段，见图1。8个首尾相互重叠的克隆覆盖了整个基因组。

图1 8对引物扩增产物电泳图

2.2 2株EV71全基因组测序结果 该研究中获得的 EV71/Luoyang2011和 EV71/Nanyang2011核苷酸序列已提交 GenBank数据库，编号分别为JN020147和JN052925。JN020147全基因组长度为7 405 bp，其中A占27.05%，G占23.94%，C占24.19%，U占24.82%;JN052925全基因组长度为7 404 bp，其中 A占26.99%，G占24.80%，C占24.22%，U占24.82%;两者均A和U丰富。两者核苷酸序列除3’末端非编码区(3’UTR)外，全部一致(表2)，5’UTR均含有742 bp，随后为6 582 bp的编码区，编码一个2 193氨基酸的多聚蛋白，最后3’UTR分别含84 bp(JN020147)或83 bp(JN052925)。

表2 2株EV71病毒基因组编码区核苷酸及氨基酸数目

2.3 2株病毒基因组核苷酸序列同源性分析结果见表3和表4。JN020147全基因序列与阜阳流行株(EU703814)同源性最高，与湖北流行株(6U 434678)同源性最低;在5’UTR区与挪威流行株(DQ452074)同源性最低，在P3区与挪威流行株(DQ452074)和台湾流行株(DQ060149)同源性最低;在3’UTR区与阜阳(HQ188292、EU703814)及上海流行株(HQ891929)同源性最高，与新加坡流行株(AF352027)同源性最低。

JN052925全基因序列与阜阳流行株(EU703814)同源性最高，与湖 北流行株(GU434678)同源性最低;在5’UTR区与广东流行株(FJ194965)同源性最高，与挪威流行株(DQ452074)同源性最低;在 3’UTR区与阜阳(HQ188292、EU703814)、上海流行株(HQ891929)同源性最高(100%)，与新加坡流行株(AF352027)同源性最低。

JN020147和 JN052925全基因序列同源性为99.3%，在VP1区同源性为99.0%，在3’UTR区核苷酸序列完全相同。

2.4 2株病毒基因组氨基酸序列同源性分析结果见表5。JN020147编码区氨基酸序列与大部分EV71同源性都较高，与 COXB3同源性最低，与COXA16同源性中等;在结构蛋白P1区(包括VP1、VP2、VP3、VP4)也与大部分EV71同源性较高，其中VP4区与大部分病毒同源性均为100%，与COXB3同源性最低，与COXA16同源性中等;在非结构蛋白P2和P3区，与COXA16同源性较高。

JN052925基因组氨基酸序列同源性结果与JN020147株类似，除编码区及P3区外，在其他区氨基酸序列同源性与JN020147完全相同。

JN020147和JN052925基因组氨基酸序列同源性为97.6%，在P3区为99.7%，在其他区同源性均为100%。

表3 JN020147与其他毒株核苷酸序列同源性的比较 %

表4 JN052925与其他毒株核苷酸序列同源性的比较 %

表5 JN020147及与JN052925其他毒株氨基酸序列同源性的比较 %

2.5 2株病毒基因遗传进化分析 根据病毒全基因序列构建的遗传进化树见图2。可以看出，JN020147和JN052925与以往国内EV71病毒C4型分离株遗传距离较近，与EV71病毒A型湖北分离株(GU434678)及COX A16型及B3、B4、B5型遗传距离较远，与核苷酸同源性比较结果一致。

图2 核酸进化树

3 讨论

自2008年以来，EV71感染在我国呈暴发状态，并出现多例死亡病例。河南省 2010年共报告HFMD 96 815例，其中重症患者8 934例，死亡48例，重症发病率高于全国平均水平。

该研究中的2株EV71毒株分别采自河南洛阳和南阳的确诊病例，这2株VP1区核苷酸序列同源性高达99.0%，氨基酸序列除基因组编码区和P3区外，同源性均为100%，说明这2株均为河南省本地株，基因在流行中有所变化，但多为无义突变，编码蛋白质无明显变化。这2株与EV71/A型的湖北流行株(GU434678)［11］同源性低，而与其他C4型国内流行株均具有较高同源性(93.1%～99.3%，92.9%～99.0%)，在遗传进化树上与EV71的C4亚型遗传距离较近，说明这2个分离株均为EV71的C4亚型，并提示EV71病毒株目前相对稳定，没有发生大的变异。这2个毒株的VP1区都与广东流行株(FJ194965)同源性最高，原因可能为:河南为劳动力输出大省，每年有大量人口输出至广东，且郑州为全国交通枢纽，两地人口往来频密，病毒可在两地间快速传播。该研究中的2个分离株与以往分离到的3株河南EV71毒株的同源性较高，说明该C4亚型毒株在河南省可能仍有广泛的分布和传播。这2株的5’UTR区、VP1区和全基因序列与我国目前分离到的EV71毒株无明显差异，毒力也没有发生显著变化。

总之，该研究对2011年河南洛阳和南阳两地区分离的EV71进行了遗传进化分析，为该病毒的基础研究及疫苗研制奠定了基础，并为制定相应的EV71防御策略提供了重要的参考价值。

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Analysis of complete genome sequence of two enterovirus 71 strains isolated from Henan

LENG Hong1)，LU Xin2)，LIU Huitao3)，MA Yunyun4)，WANG Yuanyuan2)，MA Jing2)，GUO Maofeng2)，LI Min2)，ZHAO Guoqiang2)1)Department of Immunology and Pathogen Biology，Luoyang Vocational＆Technical College，Luoyang 471000 2)Department of Microbiology and Immunology，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou U-niversity，Zhengzhou 450001 3)Department of Gastroenterology and Nephrology，Nanyang Oilfield General Hospital，Nanyang 473132 4)Department of Microbiology and Immunology，Henan Medical College for Staff and Workers，Zhengzhou 451191

enterovirus71;hand-foot-and-mouth disease;homology analysis;Henan province

Aim:To analyze the genome of two enterovirus 71 isolated strains obtained from Luoyang and Nanyang in Henan province in 2011.Methods:Two enterovirus 71 isolated strains from Luoyang and Nanyang，respectively，was obtained and the complete genome sequence and phylogenetic analysis were analyzed.Results:The nucleotide sequence of VP-1 regions in EV71/Luoyang2011 and EV71/Nanyang2011 should be classified phylogenetically as subtype C4，which were mostly close to Guangdong Strain in 2008，and shared higher sequence homology with other domestic EV71 strains of China.They were similar to each other，and nucleotide and amino acid sequence identities were 99.3%and 97.6%，respectively.The amino acid sequence identities of them had hardly variation.Conclusion:EV71/Luoyang2011 and EV71/ Nanyang2011 belong to subtype C4，and have little variation with other former EV71 strains in China.

R373.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.02.0010

*河南省医学科技攻关基金资助项目 200902006

(2011-07-07收稿 责任编辑王 曼)