高血糖对成骨细胞增殖分化影响的实验研究

梁军波 徐春丽 潘伟波 江玲军 陈海啸

糖尿病性骨质疏松症(diabetic osteoporosis)是糖尿病(diabetes mellitus)患者常见的慢性并发症之一，糖尿病骨质疏松症患者存在骨量减少，骨密度降低，骨组织结构受损等病变，因此易导致病理性骨折，致残率高，给糖尿病患者和社会造成很大的负担，虽然目前对其发病机制的研究正不断深入，但确切发病机制迄今尚未完全阐明［1，2］。

成熟骨组织主要依靠持续循环性的破骨和成骨过程，由破骨细胞和成骨细胞协同完成。为此我们有理由推测高血糖状态下，存在成骨细胞的增殖分化障碍而致上述循环被破坏，并最终导致糖尿病骨质疏松的发生。碱性磷酸酶是成骨细胞主要功能活性酶，富含于胞质中，它可分解有机磷酸，增加局部无机磷酸的浓度，促进成骨细胞的矿化［3］。本实验拟通过制作糖尿病大鼠模型，观察糖尿病大鼠股骨近端的骨密度，以及成骨细胞和破骨细胞的病理改变，同时研究高糖培养条件下成骨细胞中碱性磷酸酶的表达情况，探讨高血糖状态下成骨细胞形态和增殖分化与糖尿病大鼠骨质疏松的关系。

材料与方法

1．模型制作和分组:体重180～200g SD雄性大鼠由浙江大学实验动物中心培育，随机分成正常对照组和糖尿病组，其中糖尿病组大鼠适应性饲养3天后禁食12h，腹腔一次性注射链脲佐菌素(STZ)(美国SIGMA公司)65mg/kg，72h后尾静脉测血糖，＞16．7mmol/L为造模成功，正常对照组以等量枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。喂养条件两组一致。每周测量血糖1次，尿糖1次。

2．骨质疏松相关指标及形态学观察:上述大鼠喂养6周后，采用1%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射，充分麻醉后打开腹腔，快速开胸暴露心，经4%多聚甲醛固定液灌注后，分离各组大鼠的左侧股骨，于小动物放射成像系统(faxitron modelmx20)上，测其近段骨密度。同时取右侧股骨内髁，置于4%多聚甲醛固定液固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋。HE染色，在显微镜下观察比较糖尿病模型组和正常大鼠成骨细胞、破骨细胞的形态。

3．成骨细胞培养并检测:取出生24h内的SD大鼠的颅骨，彻底剥离骨膜后置入含DMEM培养液的培养皿中修剪成1mm3大小的骨片。加入胰酶振荡消化(37℃，2～3min)，15%胎牛血清 DMEM终止消化，吹打细胞，收集消化液，离心10min(4℃，1000r/min)，沉淀细胞置于含 15%胎牛血清DMEM培养基和PEST(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)的培养皿内，并以约5×104/cm2的密度接种于培养瓶中，培养箱内培养(37℃，5%CO2)，每2～3天换液1次。使用第3代细胞随机分为正常培养基组和高糖培养基组(葡萄糖浓度100mmol/L)，分别培养48h后，将贴壁细胞用40g/L多聚甲醛固定，而后PBS洗涤3次，按比例配制BCIP/NBT染色工作液，48孔板每孔加100μl上述BCIP/NBT染色液，室温避光孵育5～30min，直至显色至预期深浅，去除工作液，用蒸馏水洗涤终止显色。在100～200倍倒置显微镜下，计数各组细胞ALP染色阳性率。

4．统计学方法:采用UTHSCSA Image Tools 3．0(美国德克萨斯大学医学院开发)图像分析处理系统进行分析和统计单位面积阳性细胞数，数据处理采用SPSS 16．0，两组间均数比较采用t检验，两组阳性率比较采用χ2检验，以p＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．体质量和血糖的检测结果:成模前两组大鼠的体重和血糖差异无统计学意义，成模6周后发现糖尿病大鼠体重明显减轻，同时伴血糖升高，差异有统计学意义(P ＜0．05，表1)。

表1 两组大鼠成模前后体质量、血糖浓度水平的影响

2．骨组织的密度及病理变化:X线显示糖尿病组大鼠股骨骨皮质变薄，骨小梁稀疏，骨密度明显比正常对照组大鼠下降(图1)。

图1 两组大鼠左侧股骨X线观察图

正常组大鼠股骨HE染色结果表明，软骨下区骨小梁未见吸收或断裂现象，成骨细胞胞质细密，形状与骨陷窝一致，软骨下区可见新骨形成，破骨细胞少见。糖尿病大鼠股骨则见骨皮质下成骨细胞显著减少，成骨细胞呈扁平或星形，核固缩，形状与骨陷窝不一致，少见新骨形成。破骨细胞生长活跃，空骨陷窝明显增多。骨小梁排列稀疏，结构紊乱(图2)。

图2 两组大鼠股骨HE染色观察(HE，×400)

3．培养成骨细胞形态学观察及ALP染色结果:图3可见正常培养组成骨细胞可见大部分细胞贴壁生长，细胞形状呈多边形、梭形、细胞伸出较多突起，有的突起相互连接，而高糖培养组成骨细胞不能伸展开，核轮廓不清晰，生长较为分散，碱性磷酸酶染色阳性部位呈紫色细颗粒状，各成骨细胞染色深浅不等，高糖培养组成骨细胞碱性磷酸酶染色呈浅蓝色，其(ALP)阳性率为80．9%，显示其增殖分化能力减弱，而正常培养基组呈深蓝色，其阳性率为94．6%，两组差异有统计学意义(p＜0．05)。

图3 两组成骨细胞培养ALP染色(ALP，×400)

讨 论

流行病学研究发现，糖尿病患者由于代谢紊乱，普遍伴发骨质疏松症状，如X线骨密度仪检测发现30．4%糖尿病患者可出现脊柱或髋骨的骨质疏松，同时约14%～20%患者可出现骨质疏松症状，其X线检查可以观察到骨皮质变薄，骨小梁数量稀疏、紊乱，并随年龄增加而呈快速上升趋势［4，5］。本研究显示大鼠股骨X线片出现骨皮质变薄，骨密度降低等症状，同时HE染色显示骨细胞呈扁平或星形，胞质嗜碱性，细胞器不发达，少见新骨形成。空骨陷窝明显增多。骨小梁排列稀疏、变细变薄等明显的骨质疏松病理改变。大量研究表明，糖尿病骨质疏松症除与性别、年龄、糖尿病病程等因素有关外，糖尿病患者胰岛素不足、胰岛素生长因子－1(IGF－1)缺乏、晚期糖基化终末产物(AGEs)积累等因素都可以促进糖尿病骨质疏松症的发生、发展［6，7］，成熟骨组织主要靠持续、循环性的破骨和成骨过程，由破骨细胞和成骨细胞协同完成。本研究结果提示，正常培养组成骨细胞贴壁生长，细胞伸出较多突起，有的突起相互连接，而高糖培养组成骨细胞不能伸展开，生长分散，同时碱性磷酸酶染色阳性率亦降低，显示其增殖分化能力减弱，显示高血糖状态下成骨细胞减少及增殖分化能力减弱，造成成骨细胞和破骨细胞的失衡，从而影响了骨组织的代谢，可能是造成糖尿病骨质疏松症的一个原因。

综上所述，本研究结果显示糖尿病大鼠存在软骨下区成骨细胞核固缩、减少而破骨细胞生长活跃，骨小梁排列稀疏等明显的骨质疏松病理改变，同时成骨细胞内碱性磷酸酶染色阳性率亦明显降低，初步阐明了高血糖状态下成骨细胞减少及增殖分化能力减弱，造成成骨细胞和破骨细胞的失衡，从而影响了骨组织的代谢，为糖尿病性骨质疏松症的深入研究提供了一定实验基础和依据。

1 Rachner TD，Khosla S，Hofbauer LC．Osteoporosis:now and the future［J］．Lancet，2011，377(9773):1276 －1287

2 Yaturu S．Diabetes and skeletal health［J］．J Diabetes，2009，1(4):246－254

3 钟卫权．不同负荷的游泳运动及雌激素对去卵巢大鼠血清IL－6、TGF－1水平及生化指标的影响［J］．医学研究杂志，2008，37(12):86－88

4 牛银玲，邵小英．糖尿病性骨质疏松［J］．中国骨质疏松杂志，2007，13(2):138 －140

5 Shan PF，Wu XP，Zhang H，et al．Age－related bone mineral density，osteoporosis rate and risk of vertebral fracture in mainland Chinese women with type2 diabetes mellitus［J］．JEndocrinol Invest，2011，34(3):190－196

6 Fritton JC，Kawashima Y，Mejia W，et al．The insulin－like growth factor－1 binding protein acid－labile subunit alters mesenchymal stromal cell fate［J］．J Biol Chem，2010，285(7):4709 － 4714

7 Merlotti D，Gennari L，Dotta F，et al．Mechanisms of impaired bone strength in type 1 and 2 diabetes［J］．Nutr Metab Cardiovasc Dis，2010，20(9):683 －690