天门市特殊教育学校聋哑学生耳聋相关基因检测结果分析＊

何本超 徐碧生 李健勇 颜风波 郑志刚 蒋玉欢 鲍柏林 鄢烈雄

1 湖北省天门市第一人民医院耳鼻咽喉头颈外科（天门 431700）

2006年第二次全国残疾人抽样调查显示，我国现有听力障碍者2 780万人，占全国8 296万残疾人的33.5%，居各类残疾之首［1］。在我国，每年新增听力及言语障碍者近8万人，新增聋儿近3万人，其中50%是由遗传缺陷引起的，可见，遗传因素是导致耳聋的重要因素［2］。减少耳聋的发生重在早期预防与干预，而明确其遗传学病因是关键。在不同地区和不同人群中耳聋基因的突变频率、突变方式和热点突变有很大的差异，为了解天门市特殊教育学校耳聋人群的常见分子遗传病因学特点，2012年3月对天门市特殊教育学校52名聋哑学生进行GJB2、GJB3、SLC26A4、线粒体 DNA12SrRNA 4个基因的9个热点突变进行检测，报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 研究对象为湖北省天门市特殊教育学校的52名聋哑学生，原籍均为天门市，均为汉族。其中，男28例，女24例，男女比例为1.17：1；年龄5～16岁，平均11.08±3.08岁。

1.2 研究方法

1.2.1 病史资料采集及体检 病史资料采集得到研究对象及其家长的同意并签署知情同意书。调查内容包括：①一般情况：登记时间、接诊医生、姓名、性别、年龄、民族、籍贯、出生年月、居住地址、联系电话、父母亲及其听力情况。②耳聋的发病时间、发病原因、耳聋以前是否会说话、耳聋病情进展及伴随症状。③母亲妊娠期情况：传染病史、耳毒性药物应用史、生产情况；④个人史：聋前患病史、全身系统疾病、头部外伤史、环境噪声史、家庭史和耳毒性药物应用史。对所有研究对象进行耳部、视力及视野、虹膜、巩膜、甲状腺、毛发及其他体检；进行纯音测听、声导抗、ABR、40HzAERP、DPOAE、ECochG、ASSR等听力检测。

1.2.2 DNA提取 取受试者外周血3～5ml保存在4℃条件下，避免震荡，1天内送到湖北省人民医院，应用耳聋基因芯片（北京博奥生物有限公司）进行 GJB2（35delG、176del16、235delC 及 299delAT）、GJB3（538C＞T）、SLC26A4（2168A＞G、IVS7－2A＞G）以及线粒体DNA12SrRNA（1494C＞T、1555A＞G）常见致聋基因突变热点筛查 ，按试剂盒说明书进行操作。每份标本提取两份DNA，分别储存，除工作液外均保存在－80℃深低温冰箱。

1.2.3 PCR反应 将针对9个突变位点的9组引物分成A和B两个反应体系分别进行多重PCR，在每个20μl反应体系中加入待测全血基因组DNA（浓度100～200ng／μl）3μl、扩增引物混合物12.5μl、扩增试剂混合物4.5μl。PCR反应程序：37℃10min，95℃15min，96℃1min预变性，94℃30 s、55℃30s、72℃45s共32个循环，70℃45s、60℃10min。在扩增过程中，设置参数使温度以0.4℃／s的速度从94℃降温至55℃，以0.2℃／s的速度从55℃升温至70℃。

1.2.4 杂交 PCR产物加热至95℃变性10min后混合物中冰浴3min。从同一个样品模板的两个不同扩增体系管（A、B）中各取2.5μl PCR产物加到10μl杂交缓冲液管中。将14μl杂交混合液加到芯片的微阵列区域，加杂交盒上盖，封闭杂交盒后放入50℃杂交仪中1h。

1.2.5 颞骨CT检查 对检测出的SLC26A4基因突变携带者进行16排螺旋CT颞骨扫描。正常者前庭导水管外口与总脚或峡部中点直径平均1.9 mm，最小1.6mm，最大2.3mm；根据1978年Valvassor提出的诊断标准，前庭导水管外口与总脚或峡部中点直径＞1.5mm为扩大。

2 结果

2.1 52名聋哑学生均为非综合征型聋，按照WHO（1997年）的听力损失程度分级标准，均为重度和极重度感音神经性聋。

2.2 52例耳聋者中，共发现携带与遗传性聋相关基因突变者25例（48.08%，25／52），其中SLC26A4基因突变携带者9例（17.30%，9／52）、GJB2基因突变携带者12例（23.08%，12／52）、mtDNAl2SrRNA线粒体基因突变携带者4例（7.69%，4／52），未发现GJB3基因突变携带者（表1）；其中2例GJB2 35 delG合并IVS7－2A＞G基因的杂合突变，2例SLC26A4 2168A＞G合并IVS7－2A＞G基因的杂合突变。GJB2和SLC26A4基因突变携带者占基因突变总例数的84.0%（21／25）。对9例SLC26A4基因突变携带者行颞部CT扫描，9例均显示前庭水管扩大（17.31%，9／52），这9例耳聋基因芯片检测结果分别是IVS7－2A＞G纯合突变1例，IVS7—2A＞G杂合突变6例，SLC26A4 35delG合并IVS7－2A＞G基因的杂合突变2例。

3 讨论

遗传性聋的遗传背景复杂，临床表现多变，目前尚无有效药物治疗，大部分患者只能依靠配戴助听器或植入人工耳蜗等辅助手段进行康复治疗，因此，对此类疾病的早发现、早诊断、早治疗，对于患者早日融入有声社会具有重要意义。

表1 52例受检者4种耳聋相关基因的突变检测结果（例）

国人中最常见的GJB2、SLC26A4和线粒体DNA 12SrRNA3种耳聋相关基因均有突变热点。GJB2基因定位于人染色体13q11－12，全长4 804 bp，mRNA长2 3ll bp，编码区678bp，含2个外显子，编码B－2型缝隙连接蛋白（Cx26）是钾离子循环通路的一部分，对于耳蜗正常渗透压及听敏度的维持起着极其重要作用。GJB2基因的编码区发生突变可以产生无功能的缝隙连接蛋白，降低缝隙连接的通透性，影响通道的正常开闭，使钾离子回流入内淋巴液的循环障碍，导致Corti器的钾中毒，从而导致感音神经性聋（seosorineural hearing loss，SNHL）［3］。目前已报道的GJB2基因突变类型有150多种，突变方式包括移码突变、错义突变、无义突变及剪接位点突变等，其中多数患者表现为常染色体隐性遗传，大部分表现为先天性聋或语前聋。本研究对象中GJB2基因突变携带者12例（23.08%，12／52），与解放军总医院全国聋病分子流行病学调查结果（21.05%）［4］一致。

SLC26A4（solute cartier family 26，member 4 protein）即PDS基因，定位于7q31，全长为57 175 bp，编码区为2 34 3bp，由21个外显子组成，其中20外显子编码氯－碘离子转运蛋白Pendrin，780个氨基酸，主要表达于甲状腺、内耳、肾脏。解放军总医院报告SLC26A4基因突变率21%［5］；席宏等［6］报告61例非综合征性聋患者SLC26A4基因突变率为16%。本组研究对象中SLC26A4基因突变率17.30%（9／52），与上述报道相近。分析其原因可能为：不同年龄段SLC26A4基因突变检出率是不同的，有文献报告［7］，在发病和就诊年龄为0～10岁的耳聋群体中，SLC26A4基因突变的检出率均为最高（分别为34.32%和34.52%），而在较大年龄段，SLC26A4基因突变的检出率要低一些。本组研究对象平均年龄11.08岁，且因样本量有限，结果有一定的局限性。文献报道大前庭水管综合征（1arge vestibular aqueduct syndrome，LVAS）的发病与SLC26A4基因突变具有直接的因果关系，从文中结果可见，9例SLC26A4基因突变病例的颞骨CT扫描均显示前庭水管扩大，可见，对LVAS病例进行SLC26A4基因检测，有利于从分子水平明确病因，早期诊断，早期治疗。

目前大量研究已证实mtDNA突变与氨基糖苷类药物导致的耳聋密切相关，部分患者对氨基糖苷类药物有易感性，微量的药物就可以造成听力损失。一部分12SrRNA基因A1555G突变患者即使不接触氨基苷类药物，同样会发生感音神经性聋［9］。本组患者中与药物性聋相关的线粒体12SrRNA基因突变携带者4例（7.68%，4／52），其中2例母亲妊娠期注射过丁胺卡那霉素，另2例用药史不详；4例中线粒体DNA 12SrRNA基因A1555G点突变率3.85%，高于文献报道的3.43%［10］。

既往有研究报告GJB3基因突变携带率0.56%（1／177）［8］，本组研究对象中未发现 GJB3基因突变者，其原因可能与样本量偏少有关，并不能确认天门市耳聋人群中没有该基因突变者存在。因此，有待于扩大样本量进一步研究。

从本研究结果看，SLC26A4基因突变患者多数有残余听力，对这类患者应嘱避免各种外伤、感冒或耳毒性药物的使用，避免加重耳聋的诱因及注意预防甲状腺肿的发生［11］，植入人工耳蜗效果良好；GJB2基因突变者，应告之在婚前需行耳聋基因检测，避免双方为同型遗传性聋者婚配，预防聋儿出生；与药物性聋相关的rtDNA12SrRNA线粒体基因突变携带者，应告知禁用耳毒性药物，尤其是其母系成员更应禁用耳毒性药物，避免或减少亲代及子代发生遗传性聋，对于已由耳毒性药物导致的听力损失患者，植入人工耳蜗有效。

1 孙喜斌，魏志云，于丽玫，等.中国听力残疾人群现状及致残原因分析［J］.中华流行病学杂志，2008，29：643.

2 陈金霞，张桂茹.吉林省非综合征性耳聋分子病因学分析一线粒体DNA 12SRrRNAAl555G位点突变基因筛查［J］.中国实验诊断学，2007，11：287.

3 于飞，戴朴，韩东一.GJB2基因突变及语前遗传性非综合征性耳聋［J］.国外医学耳鼻咽喉科学分册，2005，29：359.

4 于飞，韩东一，戴朴，等.190例非综合征耳聋患者GJB2基因突变序列分析［J］.中华医学杂志，2007，87：4.

5 戴朴，韩东一，曹菊阳，等.家族性大前庭水管患者的PDS基因型分析［J］.临床耳鼻咽喉科杂志，2006，20：147.

6 席宏，张芩娜.大前庭水管综合征SLC26A4基因突变分析［J］.中国药物与临床，2011，11：394.

7 王建国，袁永一，韩冰，等.不同年龄的重度耳聋患者常见耳聋基因突变的阳性率分析［J］.中华耳科学杂志，2010，8：396.

8 梁爽，孙喜斌，韩睿 ，等.非综合征型聋患者耳聋相关基因检测结果分析［J］.听力学及言语疾病杂志，2011，19：10.

9 Matsunaga T，Kumanomido H，Shiroma M，et a1.Deafness due to A1555Gmitochondrial mutation without use of aminoglycoside［J］.Laryngoscope，2004，114：1 085.

10 刘新，戴朴，黄德亮，等.线粒体DNA A1555G突变大规模筛查及其预防意义探讨［J］.中华医学杂志，2006，86：1 318.

11 Scott DA，Wang R，Kreman TM，et a1.The Pendred syndrome gene encodes a chloride－iodide transport protein［J］.Nature Genet，1999，21：440.