灰树花发酵动力学研究

朱会霞

（衡水学院生命科学系，河北 衡水 053000）

灰树花是食、药兼用覃菌，属担子菌亚门层菌纲非褶菌目多孔菌科树花菌属。具有松覃芳香，肉质柔嫩，味如鸡丝，脆似玉兰，是极其珍贵的高档食用覃菌。其具有突出的医疗保健功能。由于富含铁、铜和VC，能预防贫血、坏血病、白瘫风[1-2]，防止动脉硬化和脑血栓的发生；还具有抑制高血压和肥胖症之功效[3]；大量的药理药效的研究证明，灰树花多糖具有显著的抗肿瘤[4-5]、降血糖、抗肝炎、抗HIV病毒以及改善免疫系统功能等功效。

灰树花培养过程中，深层发酵法具有周期短、成本低、产量大等特点。利用深层发酵法研究灰树花菌丝体及多糖是研究的热点之一。灰树花发酵研究过程中，对灰树花多糖、发酵动力学的研究较少，本文以灰树花真菌为研究材料，对其发酵过程及其动力学进行了研究，通过对其发酵动力学的研究，以期掌握灰树花发酵规律，为灰树花扩大培养以及工业化大生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

灰树花菌种：本实验室保藏。

1.1.2 仪器

食用菌发酵罐（50 L）：江苏省镇江日泰生物工程设备有限公司；恒温振荡器（CHA-S，往复）：金坛市天境实验仪器厂；高压灭菌锅（YXQ-LS-50SII）：郑州南北仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基制作及培养

1.2.1.1 母种培养基及培养

斜面培养基：（PDA培养基）其配方为20%的土豆，2%葡萄糖，2%的琼脂，pH自然。从母种试管中切取蚕豆大小的菌丝块接种于斜面中央28℃恒温培养10 d。

1.2.1.2 种子基础培养基及培养

种子培养基（质量分数，%）：马铃薯20，葡萄糖2，蛋白胨0.2，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.1，pH自然。

种子培养：斜面菌种经平板活化后，切成菌块，接入装有75 mL种子液的300 mL三角瓶中，于28℃，转速为140 rpm的恒温摇床上振荡培养，待菌丝旺盛生长并形成较多菌丝球后，转接入新的种子液中继代培养。

1.2.1.3 液体发酵培养基及培养方法

液体发酵培养基（质液体量分数，%）：玉米浆10，葡萄糖 2，蛋白胨 0.3，酵母膏 0.7，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.05，pH 自然。

摇瓶培养方法：将种子液按一定的接种量，接入发酵培养基中，特定转速及装液量条件下，28℃恒温摇床上振荡培养10 d。

1.2.2 多糖测定

采用苯酚—硫酸法。

1.2.3 生物量菌体干重的测定

取一定量的发酵液，用已烘干并称重的滤纸过滤，用水冲洗至洗液不再带有发酵液颜色为止。80℃恒温烘箱中烘至恒重，干燥器中冷却至常温，称重。3500 r/min离心15 min，弃上清液，菌体用蒸馏水洗涤至无发酵液颜色，60℃烘干至恒重，称重。

2 动力学模型[6]

本研究采用Weiss等[7]所用的Logistic方程和Luedeking-Piret方程来描述灰树花真菌多糖发酵的动力学过程。菌体生长描述采用Logistic方程：

式中：xm为最大菌体浓度，比生长速度设为常数μ，

该方程的积分式为：

由实验数据，以ln[x/（xm-x）]对t作图得的直线斜率即为μ，截距为：ln（x0/（xm-x0）产物（多糖p）的形成和底物（葡萄糖s）消耗采用Luedeking-Piret方程：

t=0时 p=p0，方程中 m1、m2为模型参数，依发酵条件的变化而不同。把方程（1）代入方程（3）得：

稳态时，dx/dt=0 x=xm

则由方程（3）得：

方程（5）可写成如下形式：

其中 μ、xm、x0、m1均已知。因此以[p（t）-p0-m1B（t）]对A（t）作图，直线斜率即为m2值。发酵过程中的底物消耗主要与菌体生长和产物合成及其代谢有关，因此，底物消耗速度可由下式表示：

式中：b1=m1/Yp/s+Ke、b2=1/Yx/s+m2/Yp/s，依上述同一原理当菌体生长处于稳态时，即dx/dt=0，可利用（10A）式求得b1=-[（ds/dt）/x]稳定，进而对（10A）式积分得：

依同样原理，即以[S0-S（t）-b1B（T）]对 A（t）作图，所得直线斜率为b2。

式中：b1为动力学参数，[g/（g·h）]；m2为动力学模型参数，（g/g）；xm为最大菌体浓度，（g/L）；m1为动力学模型参数，g/（g·h）；p0为初始多糖浓度，（g/L）；b2为动力学参数，（g/g）；p 为多糖浓度，（g/L）；s为底物浓度，（g/L）；x为菌体浓度，（g/L）；pm为最大多糖浓度，（g/L）；t为时间，d；μ 为动力学模型参数，（1/h）；s0为初始底物浓度，（g/L）；x0为初始菌体浓度，（g/L）。

3 结果与讨论

3.1 灰树花真菌发酵过程中菌体及多糖代谢变化

灰树花真菌7 L发酵罐培养中，转速150 r/min，通气量200 L/h，接种量10%，28℃培养10 d发酵过程曲线如图1所示。

图1 7 L发酵罐发酵培养灰树花真菌过程曲线Fig.1 The fermentation process of curve for Grifola frondosa fungal in 7Lfermentor

灰树花真菌发酵过程中，还原糖前、中期迅速被利用，菌体量达到最高后，还原糖开始缓慢下降。菌体达到最大量时还原糖消耗速率分别为0.27 g/L·h。此刻还原糖降至10%以下。总糖变化趋势与还原糖基本相似。这与菌体生长、多糖生成利用糖有关。

随着培养时间的增加，多糖逐渐生成，并且多糖的形成与菌丝体呈一定正相关性。菌丝体干重最大值22.35 g/L，多糖最大量为1.40 g/L，菌体及多糖产量达到最大时间为9 d。

发酵培养过程中，发酵液的黏度随发酵时间的延长而逐渐增大，这与发酵过程中，菌体量、多糖产量不断增加有关，发酵结束时，发酵液黏度达到5.1 Pa·s。

3.2 灰树花真菌发酵动力学特征

3.2.1 灰树花真菌菌体发酵动力学模型

根据发酵过程实验数据xm=22.35（g/L）和动力学模型方程（2A），以ln[x/（xm-x）]对t作图得直线斜率，即模型参数：μ=0.66，x0=1.62（g/L）。将模型参数代入方程（2B）求得发酵过程菌体生长的动力学模型如下：

根据设定发酵条件进行灰树花发酵试验，发酵过程中菌体产量与模拟计算如图2、表1所示。

图2 灰树花真菌发酵菌体生长动力学模型与实验数据拟合曲线Fig.2 The fitting curve for frondosa fungal fermentation cell growth kinetics model and the experimental data

表1 灰树花真菌发酵菌体生长动力学模型计算值、测定值对比表Table 1 The contrast of Grifola frondosa fermentation dynamic model and deter mination data

如图2、表1所示，灰树花真菌发酵中，菌体生长动力学模型与试验数据拟合良好，将模型计算值与实验数据点进行比较，发酵动力学模型计算得到的菌体量与实验数据点进行比较，相差不大，最大相对误差为4.96%，平均相对误差为2.4%，表明实验结果与动力学模型值基本相符。菌体生长动力学模型能很好的表达灰树花真菌7 L发酵罐发酵培养菌体的生长过程。

3.2.2 多糖生成动力学

依据动力学模型参数μ=0.66，x0=1.62和实验数据xm=22.35，p0=0.02（g/L）及动力学模型方程（5），计算得到 m1=0.0068（g/g/d）。以[p-p0-m1B（t）]对 A（t）作图得发酵动力学模型参数m2=0.033（g/g）。将模型参数代入方程（7A），即可求得多糖生成动力学模型：

根据设定发酵条件进行灰树花发酵试验，发酵过程中多糖产量与模拟计算如图3、表2所示。

图3 灰树花真菌多糖合成模型与实验数据拟合曲线Fig.3 The fitting curve for frondosa fungal EPS synthesis kinetics model and the experimental data

表2 灰树花真菌发酵多糖合成模型计算值与测定值对比表Table 2 The contrast of Grifola frondosa EPS synthesis dynamic model and deter mination data

图3、表2描述了多糖合成动力学模型计算值与测定值之间的比较，模型拟合实验点的最大误差15.83%，平均相对误差为5.60%，说明拟合情况较好，多糖动力学模型基本上能描述出随发酵时间的延长多糖合成情况。

3.2.3 底物（葡萄糖）消耗动力学

依方程（10B）条件，[s0-s-m1B（t）]对[x（t）-x0]作图得到的直线斜率为灰树花真菌多糖发酵过程底物糖消耗模型参数，b2=2.55，b1是根据（10A）式菌体生长处于稳态下的b1=（ds/dt）/xm方程作图计算得到，b1=0.24，从而获得底物消耗的动力学过程：

根据设定发酵条件进行灰树花发酵试验，发酵过程中底物糖变化与模拟计算拟合情况如图4所示。

图4 残糖消耗模型与实验数据拟合曲线Fig.4 The fitting curve for residual sugar kinetics model and the experimental data

图4显示了灰树花真菌发酵过程底物糖消耗动力学模型与实验数据比较曲线，从图中可以看出，两者比较吻合，最大相对误差是19.14%，而平均相对误差为7.9%，说明模型能较好的描述灰树花真菌发酵过程中底物糖的消耗过程。

4 结论

灰树花真菌发酵与一般微生物多糖发酵特性类似，采用Logistic和L-P方程对灰树花真菌发酵发酵得到了较好地理论描述，并取得了相关的动力学模型参数，经研究拟合，菌体生长动力学模型、多糖生成动力学模型及底物糖类的消耗模型与试验数据拟合良好，平均相对误差分别为2.4%、5.60%和7.9%，表明实验结果与动力学模型值基本相符。

[1]Ooi V E C.Hepatoprotective effect of some edible mushrooms[J].Phytotherapy research,1996,10(6):536-538

[2]Kubo K,Nanba H.Anti-hyperliposis effect of maitake fruitbody(grifola frondosa)[J].Biol Pharm Bull,1997,20(7):781

[3]Yoshioka S,Ohno N,Miura T,et al.Immunotoxicity of soluble beta gulcans indced by indomethacin treatment[J].FEMS Immunol Med microbial,1998,21:171

[4]金国虔,叶波平,奚涛.灰树花胞内多糖抗辐射作用的初步研究[J].药物生物技术,2003,10(1):40-42

[5]王清吉,宋爱英,史美丽,等.灰树花发酵液多糖的抗辐射保护作用研究[J].食用菌,2002(5):35-36

[6]李信,许雷,蔡昭铃.蛹虫草菌胞外多糖发酵及其发酵动力学[J].生物工程学报,1999,15(4):507-511

[7]Weiss R M,Ollis D F.Biotechnol.Bioeng.,1980,22:859-873