高效液相色谱测定维生素C方法的研究进展

朱佳，孙杰

（南京市产品质量监督检验院，江苏 南京 210028）

VC又称作抗坏血酸，是维持机体正常生活活动所需要的一类小分子有机化合物，主要存在于新鲜蔬菜和水果及以其为原料的食品中。VC可促进胶原蛋白抗体，具有抗癌的作用；它能参与神经介质、激素的生物合成；能将胆固醇转化为胆汁酸，使高胆固醇血症患者的胆固醇下降；能将Fe3+还原为Fe2+，使其易于吸收，有利于血红蛋白的形成。但人体自身不能合成VC，必须由食物中摄取。我国食品营养强化剂使用卫生标准（GB 14880－1994）中，VC允许在水果、罐头、果泥、饮料、硬糖、婴幼儿食品等适量添加，各种强化和天然食品中的VC含量是食品检测中的常规项目。因此，研究和掌握VC的性质，准确测定VC的含量,对饮食健康、医疗保健都具有十分重要的意义。

现有的VC的检测方法有很多，一般如光度分析法、化学发光法、电化学分析法等，如国家标准中，GB/T 9695.29－1991《肉制品 维生素C含量测定》、GB/T 5413.18-1997《婴幼儿配方食品和乳粉维生素C的测定》、SN/T 0869-2000《进出口饮料中维生素C的测定方法》，均采用荧光光度测定法；GB 7303－2006《饲料添加剂维生素C》和GB 14754－1993《食品添加剂维生素C》则采用碘量法，而GB/T 6195-1986《水果、蔬菜维生素C含量测定法》采用2，6－二氯靛酚滴定法。由于VC具有较强的还原性，在中性和碱性条件下不稳定，遇热容易破坏，上述方法一般具有试剂不稳定，或操作步骤复杂、费时等缺点，在样品处理过程中很容易使VC损失，因此在使用中有较大的局限性。

近几年，维生素的检测技术已经得到重大的发展，特别是现代分析仪器与电脑技术的高度结合。高效液相色谱法HPLC是目前最常用的分析手段，能进行快速、灵敏、准确测定，并可与其他分析技术联用，需要的样品量小，而且可配置不同的检测器。近年来，用高效液相色谱测定VC含量已经有不少报道，但是实验的色谱条件有很大差异（见表1）。本文对近年来有关VC的测定方法进行了比较，对色谱柱、浸提剂、流动相、流动相pH、流速、柱温、检测器等色谱测定条件进行讨论，探索更确切的测定方法。

1 色谱测定条件

1.1 色谱柱的选择

反相色谱柱具有非常广泛的应用和较长的使用寿命，近年来有关液相色谱测定VC的方法多数采用反相色谱柱。C18和C8都适用于水溶性和脂溶性维生素的测定。离子交换色谱也可以用于维生素的测定，但与反相色谱相比，寿命较短。陈忠明的文献中指出，离子交换色谱柱易于不可逆地吸附某些样品浸出液中的杂质，导致柱性下降且难以再生[1]。

表1 部分HPLC方法测定VC的条件Table 1 Determination of Vitamin C by high performance liquid chromatography

1.2 浸提剂的选择

VC易溶于水，对热、碱性、氧、光都很敏感，但在干燥或酸性条件下却较稳定，所以宜用酸性水溶液作为浸提剂[1]。偏磷酸是VC的最佳稳定剂，且具有沉淀蛋白质的作用[2]。但其价格较贵，在室温下放置易转化成正磷酸，降低对VC的稳定性。草酸廉价易得，有与磷酸相近的稳定性。但草酸对高蛋白质样品，可能有过滤困难。根据样品类型和色谱条件，也有用柠檬酸，醋酸等，对于饮料也有用蒸馏水直接稀释的。

1.3 流动相的选择

反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。通常多用缓冲盐体系作为测定水溶性维生素的流动相。VC的出峰时间随流动相中极性调整剂含量的降低而保留时间逐渐延迟。对于基体复杂的样品而言，保留时间的推迟有利于组分的分离。雍莉文献报道采用甲醇-或乙腈-KH2PO4作流动相测定饮料中VC，VC的保留时间短，对于组分较复杂的保健食品和果蔬样品，VC的色谱峰往往不易与杂质峰分离而干扰测定[3]。

由于VC极性强，出峰早，易受早洗脱的杂质干扰，因此多在流动相中加入铵盐作为离子对试剂以增进保留。王爱月的实验结果表明，流动相中加入辛烷磺酸钠，能够抑制VC的离子化，改善峰形[4]。

也有试验报道，用醋酸、草酸的稀释液作为流动相，分离效果也比较好。胡志雄报道，采用2%醋酸溶液（pH 2.5）作流动相，对抗坏血酸进行反相色谱评价，结果表明抗坏血酸有较适当的色谱保留时间和很高的柱效，峰形对称无拖尾[5]。王艳颖报道，用0.1%的草酸作为流动相测定VC，相关系数为0.9993，线性关系较好，回收率达到97.4%～102.1%[6]。

1.4 流动相pH的确定

控制流动相的pH可以调节流动相的电离，使其在色谱柱上有一定的保留，达到调节保留时间、控制分离度的目的。李连朝等报道，当流动相pH在2.0～3.0之间，VC峰的K较为理想，但为了使色谱柱有较长的寿命，故不选pH为2.0，因为当pH接近2.0时键合成反相固定相的硅胶和烷基化合物之间形成的化学键被酸解；另一方面，随着pH的增大，VC在流动相中的稳定性降低，而且VC峰的拖尾现象也愈来愈明显[7]。

1.5 流速和柱温选择

流速过低，分析时间长，流速过高，泵压升高影响仪器寿命。通常流速选择为1 mL/min。

雍丽等报道，改变柱温从10℃～40℃，结果表明VC的保留时间随温度增高而降低，柱温在20℃～30℃范围内VC的色谱峰面积最大[3]。

1.6 检测器的选择

对VC的检测可以使用紫外可变波长检测器、二极管阵列检测器或电化学检测器。紫外检测器花费低，但只能通过保留时间确定，定性效果不好。二极管阵列检测器，结合色谱的保留时间和光谱图可以很好的对样品进行定性分析，分析峰纯度。电化学检测器灵敏度高。

2 与国家标准的比较

与国家标准方法中VC的荧光光度测定法相比较，邵丽华的研究结果表明，其研究建立的HPLC法与国家标准的荧光法相对比，并经统计学分析，差异无显著性，说明液相色谱的测定结果与国家标准方法一致[8]。

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[2]鲍士旦.土壤农化分析[M].北京:中国农业出版社,1980:359-364

[3]雍莉,黎源倩,李敏,等.高效液相色谱法快速测定保健食品和果蔬中的VitC[J].现代预防医学,2005,32(3):247-248

[4]王爱月,张向兵,李发生.高效液相色谱法测定食品及保健品中维生素C含量的研究[J].中国卫生检验杂志，2006,16(10):1175-1176

[5]胡志雄,张维农.HPLC-DAD测定果汁饮料中抗坏血酸总含量[J].武汉工业学院学报,2005,24(3):11-14

[6]王艳颖，姜国斌，胡文忠.高效液相色谱法测定草莓中维生素C含量[J].大连大学学报,2006,27(2):21-22

[7]李连朝,康靖全,杨德祥,等.用反相高效液相测定食物、药物和生理液中的维生素C[J].色谱,1986,4(6):334-338

[8]邵丽华,李静涛,郭帅,等.饮料中还原型维生素C与总维生素C测定方法的研究[J].营养学报，2007,29(2):192-194

[9]李小娟,杨润.反相高效液相色谱法测定保健食品中维生素C[J].江苏预防医学，2004,15(1):63-64

[10]莫海涛,杜玉兰,黎庆涛,等.反相高效液相色谱法测定发酵饮料中有机酸和维生素C的含量[J].食品工业科学,2007(2):24-27

[11]丁健桦.HPLC法初步研究维生素C的稳定性含量[J].食品工业,2004(1):44-45

[12]高申.食品中维生素C含量的测定[J].天津化工,2002(4):39-40

[13]赵建峰.HPLC法测定维生素C口含片中维生素C的含量[J].上海医药,2006,27(3):115-116

[14]邵桃玉,赵国琦.高效液相色谱法测定维生素的研究[J].饲料工业,2007,28(18):55-58