大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

张青峰，刘咏煌

（1.贵州省遵义医学院珠海校区，广东 珠海 519041；2.贵州省遵义医学院珠海第五附属（珠海）医院，广东 珠海 519100）

非酒精性脂肪肝（NAFLD），是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。主要包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化和肝硬化。NAFLD现已成为常见肝病之一，疾病随病程的进展表现不一。日益增多的资料表明，NAFLD患病率正在逐年增加，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，是全球普遍关注的医学问题和社会问题。对于NAFLD目前没有特效治疗法。非酒精性脂肪肝其肝细胞线粒体的β氧化增加，当消耗完体内的抗过氧化物物质时，就容易产生活性氧，氧化应激引起的改变可能在NAFLD中起重要作用。树莓总黄酮具有很强的抗氧化活性，能够降低脂肪肝氧化应激水平。本试验旨在用喂养高脂饲料的方法来建立稳定的非酒精性脂肪肝模型，为进一步研究树莓总黄酮对大鼠非酒精性脂肪肝的防治效果做前期准备。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠40只（雄性），体重在160～200 g/只，购自广东省实验动物中心。饲养条件为室温22℃±1℃，湿度为55%±10%。

1.2 饲料 普通基础饲料购自广东省实验动物中心，高脂饲料由82.5%基础饲料+2%胆固醇+10%猪油+0.5%胆酸钠+5%蛋黄粉组成。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 用普通基础饲料喂养SD大鼠，一周后，将40只SD大鼠随机分为两组，其中正常对照组有10只，模型组有30只。

1.3.2 高脂饲料的制备 首先按照高脂饲料的配方比例称取相应的量：普通饲料（82.5g/kg）、胆固醇（20g/kg）、猪油（100g/kg）、胆酸钠（5g/kg）、蛋黄粉（50g/kg）。将普通基础饲料粉碎，与胆固醇、胆酸钠、蛋黄粉混匀，再加入液态的猪油混匀，最后加入适量的水，做成条状，用烤箱在80℃温度下烘烤至干，备用。

1.3.3 模型建立 正常对照组饲喂普通基础饲料，模型组饲喂高脂饲料，每组喂养100g/d，自由饮水，每周称重一次并记录。

1.3.4 标本采集 大鼠饲喂12周后，取材之前空腹12h，用5%水合氯醛溶液（0.7mL/100g）将大鼠腹腔注射麻醉，固定后迅速解剖，采集心脏血5mL于抗凝管分装并标记，将所取的血离心（2 500 r/min，15 min）获取血清并立即送往遵义医学院珠海附属医院进行血清指标检测。取出肝脏，用生理盐水冲洗干净后置于10%甲醛中保存待检。

1.3.5 肝脏病理学观察 采血后将大鼠肝脏取出，观察肝脏的大小、形状、颜色，并详细记录观察结果。然后从肝小叶上切取一块肝组织（大约1 cm×1 cm×0.2～0.3 cm）置于10%福尔马林溶液中固定24h左右，制作成石蜡切片，染色后在显微镜下观察结果。

1.3.6 统计学处理 用SPSS12.0统计软件中的单因素方差分析进行统计学处理，试验数据用x±s表示。P＜0.05表示差异显著，有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠肝脏的一般情况 正常对照组的肝组织形态正常，颜色鲜红，表面光滑，边缘锐利，质地红润柔软。模型组的肝脏体积明显增大，重量也比正常对照组重，颜色呈棕黄色，肝叶粘连，肝脏切面油腻。

2.2 肝脏指数 正常对照组和模型组的体重、肝湿重、肝指数（肝重/体重）结果见表1。与正常对照组相比，模型组体重无明显变化（P＞0.05），肝湿重和肝指数显著增高（P＜0.01）。

表1 SD大鼠的体重、肝湿重、肝指数比较

2.3 血清指标 模型组血清指标TC、TG、ALT、AST、HDL-C、LDL-C含量变化与正常对照组的对比情况见表2。由表2可见，模型组与对照组相比血清TC、TG、ALT、AST、LDL-C水平显著升高，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；模型组HDL-C水平低于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 大鼠各血清指标比较

图1 模型组肝组织镜检观察结果

2.4 肝脏病理学改变 由病理照片（图1和图2）可见，正常对照组的肝小叶结构完整清晰，肝细胞无脂肪变性，细胞核位于细胞中央；模型组的肝细胞体积增大，有大量的空泡状细胞，肝细胞脂肪变性明显，细胞核被挤向一边，部分细胞出现气球样变。按照病理学对脂肪肝的分级标准将脂肪肝分为轻度、中度和重度：低倍镜下，肝细胞脂肪变性占肝小叶1/3～1/2者为轻度脂肪肝；占肝小叶1/2～2/3者为中度脂肪肝；占肝小叶2/3以上或者肝细胞弥漫脂肪性变性呈渔网状者为重度脂肪肝。模型组大鼠的脂肪变性都在中度脂肪肝以上。

图2 正常对照组肝组织镜检观察结果

3 讨论

非酒精性脂肪肝是指除酒精以外的各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变，主要病因是由于过多摄入热量，身体肥胖所致，用高脂饲料造模就是利用了这个原理。从试验结果看，模型组大鼠的肝脏指数——肝湿重、肝指数都明显高于正常对照组。从病理学角度观察看，模型组大鼠的肝脏呈棕黄色，切面油腻，肝细胞体积明显增大，细胞核被挤到一边，有大量空泡状细胞，具备人类脂肪肝特征。这些都说明改良的高脂饮食造模成功。

本试验通过饲喂大鼠高脂饲料成功地建立了动物非酒精性脂肪肝模型，在造模12周后，模型组的血清指标 TC、TG、ALT、AST、LDL-C 明显高于正常对照组，HDL-C明显低于正常对照组，说明检测血清TC、TG、ALT、AST、LDL-C、HDL-C 等指标在一定程度上可以反映非酒精性脂肪肝的病变程度。

饲喂大鼠高脂饲料成功地建立了非酒精性脂肪肝模型，说明本试验所用的高脂饲料配方对于建立非酒精性脂肪肝模型是可行的，但也有一定的问题。因饲料中掺入了胆固醇、猪油等油腻物质，使饲料性质发生改变，且有异味，动物易出现“厌食”或腹泻；另外，造模所需的时间长、病变轻。然而由于该模型制作方法简便、重复性好、价格低廉、动物死亡率低、复制率高，病变有渐进性发展过程，造模停止后病变逆转缓慢便于药物干预研究，因此仍然是国内外最常用的脂肪肝模型。

4 结论

通过改良的高脂饲料饲喂SD大鼠12周后，进行病理学观察和血清指标检测，证明SD大鼠非酒精性脂肪肝模型建立成功，可以为后续研究奠定理论和实践基础。

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