响应面法优化蒸馏型牛奶酒发酵工艺

马荣山，王清，邢艳芳

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110161）

奶酒是以乳及乳制品为原料，经酵母菌和乳酸菌发酵制成的饮料酒，按制作工艺可分为发酵型奶酒和蒸馏型奶酒[1]。发酵型奶酒风味独特，营养丰富，有良好的保健作用[2-4]，但常温下无法久贮，因而逐渐演化产生了蒸馏型奶酒。蒸馏型奶酒是由乳清经发酵后蒸馏制成的，是蒙古族独具民族特色的乳饮料，其酒体清亮透明，有纯正、清雅、和谐的乳香与酒香，微酸爽口，含有多种维生素和氨基酸，有特殊的保健功能和辅助治疗作用[5-6]。蒸馏奶酒杂醇油和甲醇含量也特别低，是一种既营养又卫生的低度酒[7]。

目前，人们对酒的需求逐渐向营养化、功能化转变，奶酒会被越来越多的人重视。本研究以牛乳为主要原料，通过新的发酵工艺提高蒸馏奶酒的质量并使其更符合大众的口味，有较大的市场价值及发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

鲜牛乳、白砂糖：市售；

酵母菌：安琪牌葡萄酒高活性干酵母；乳酸球菌：沈阳农业大学食品学院酿造实验室保藏；

柠檬酸、酒石酸钾、氢氧化钠、硫酸铜、亚铁氰化钾等试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

HH-6恒温水浴锅：国华电器有限公司；HG330恒温培养箱：南京实验仪器厂；酒精比重计：河北省沧县杜生热工仪表厂；糖度计：沈阳市玻璃计四厂；全玻璃蒸馏器等。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 主要分析测定方法

酒精度测定：酒精计法；总酸测定：酸碱中和法；总酯测定：指示剂法[8]。

1.3.3 发酵技术要点

1.3.3.1 原料乳的验收

选择不含抗生素及防腐剂的新鲜牛乳为原料，按GB5409-1985《牛乳检验方法》执行。

1.3.3.2 巴氏灭菌

调制后的乳清加热到65℃，保温30 min，以杀灭有害微生物，确保发酵顺利进行。

1.3.3.3 发酵剂的制备

酵母菌发酵剂：干酵母→10 mL 5%蔗糖溶液，28℃活化30 min→1 mL活化酵母菌→10 mL含8%蔗糖的乳清，培养48 h→1 mL酵母菌→100 mL含8%蔗糖的乳清，培养48 h→酵母菌发酵剂；

乳酸菌发酵剂：乳酸菌干粉→10 mL脱脂乳培养基，30℃培养48 h→1 mL乳酸菌液→100 mL脱脂乳培养基中，30℃培养48 h→乳酸菌发酵剂。

1.3.3.4 发酵

经调制灭菌的乳清液中依次接入定量的酵母菌和乳酸菌发酵剂，30℃下发酵培养7 d。发酵结束后，过滤除去蛋白质沉淀以及菌体等杂质，煎酒停止发酵。

1.3.3.5 蒸馏

发酵结束后，进入蒸馏阶段。经2次蒸馏的奶酒酒精体积分数可以达到15%～25%。

1.4 试验设计

1.4.1 单因素试验

在酵母菌和乳酸菌接种比例为4∶1、30℃发酵7 d的条件下，选择初始糖度、初始pH、接入乳酸菌时间、混合接种量进行单因素试验，通过对成品酒的酒精体积分数、总酸含量、总酯含量以及感官评分的综合评定，考察各因素对发酵的影响，感官评价标准见表1。

表1 感官评价标准Table 1 Criterion of sensory score for distilled milk wine

1.4.2 响应面法优化蒸馏型奶酒发酵工艺

在单因素试验基础上，根据Minitab 15软件中响应面设计程序的Box-Behnken设计，以X1初始糖度、X2初始pH、X3接入乳酸菌时间、X4混合接种量为自变量（自变量编码值1、0、－1分别代表自变量的高、中、低水平），Y酒精体积分数为响应值，对蒸馏型奶酒的发酵工艺进行优化，试验因素和水平见表2。

表2 Box-Behnken试验因素及水平表Table 2 Variables and levels in Box-Behnken central composite design

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 初始糖度对发酵的影响

初始糖度对发酵的影响，见表3。

表3 初始糖度对成品酒质量的影响Table 3 Effect of initial sugar content on the quality of distilled milk wine

酿酒酵母属于乳糖非发酵型酵母，不能利用乳清中的乳糖发酵产生乙醇，因此用蔗糖额外补充糖分。由表3可知，糖度过高或过低都会对发酵产生不良影响，调整发酵液的初始糖度为19°Bx时，成品酒的酒精体积分数最高，感官评价最好。

2.1.2 初始pH对发酵的影响

初始pH对发酵的影响，见表4。

表4 初始pH对成品酒质量的影响Table 4 Effect of initial pH value on the quality of distilled milk wine

酵母菌适宜在中性或微酸性的环境中生长，pH的变化会影响其生长和产物的合成。酸度高有利于抑制杂菌，但使成酒略带涩味；酸度过低则易受微生物侵染，且成品寡淡，欠爽口[9-10]。从表4可以看出，调整乳清的初始pH到4.5时，成品的酒精度较高，各项指标较好，风味口感最佳。

2.1.3 接入乳酸菌时间对发酵的影响

接入乳酸菌时间对发酵的影响，见表5。奶酒的发酵是酒精和乳酸联合发酵，酵母发酵产生的乙醇和乳酸菌发酵产生的乳酸作用生成乳酸乙酯，赋予奶酒独特的风味。接入酵母菌之后，乳酸菌的接入时间不同会导致成品酒酒体有机酸组成和风味物质不同[11]。由表5可知，酵母菌和乳酸菌一起接入（0 h），成品酒质量较差，酒精体积分数也不高。在酵母单独发酵24 h后接入乳酸菌可使菌种之间达到良好的协同作用，奶酒的酒精体积分数最高，感官评价最好。

表5 接入乳酸菌时间对成品酒质量的影响Table 5 Effect of the time that inoculate lactobacillus on the quality of distilled milk wine

2.1.4 混合接种量对发酵的影响

混合接种量对发酵的影响，见表6。

表6 混合接种量对成品酒质量的影响Table 6 Effect of inoculating amount of mix-fermentation on the quality of distilled milk wine

酵母菌和乳酸菌的混合接种量对成酒的品质有很大的影响。若酵母菌的接种量太少，则发酵时间延长，且产生的乙醇量较低；乳酸菌接种量过低会导致成品酸度降低、口味寡淡，且影响产品中乳酸乙酯的形成；如果酵母菌接种量太多，菌种生长过快、过密，会导致大量的酵母菌早衰和菌体自溶现象，产生苦味和酵母臭味，从而影响产品的品质；乳酸菌接种量太多，则会产生大量的乳酸，使产品酸度过高，影响成品酒风味[12-13]。从表6可知，混合接种量为8%时，成品酒精体积分数达到了20.6%，产品口味及香气适宜。

2.2 响应面法优化蒸馏奶酒发酵工艺

2.2.1 模型的建立及方差分析

模型的建立及方差分析，见表7。

对表7的试验数据进行回归分析，得到二次多元回归方程（模型）：

该模型进行方差分析结果见表8，模型系数显著性检验见表9。

表7 Box-Behnken试验设计及结果Table 7 Results of Box-Behnken central composite design

表8 回归模型方差分析Table 8 Analysis of variance of the developed regression equation

从表8可以看出，该模型极显著（P<0.01）；因变量与自变量之间的线性关系以及平方、交互作用极显著（P<0.01）；失拟度不显著（P>0.05），表明该方程对试验拟合良好，可用此模型对响应值进行分析和预测。

由表9回归系数显著性检验结果可知，模型中接入乳酸菌时间、混合接种量对酒精体积分数的影响极显著（各二次项P<0.01）；初始糖度对酒精体积分数的影响显著（二次项P<0.05）；初始糖度与接入乳酸菌时间、初始糖度与混合接种量、初始pH与接入乳酸菌时间的交互作用显著（P<0.05）；接入乳酸菌时间与混合接种量的交互作用极显著（P<0.01）。

表9 回归方程系数显著性检验Table 9 The significant test of regression coefficients

2.2.2 响应面分析及优化

初始糖度和初始pH对酒精体积分数的影响，见图1。

图1 初始糖度和初始pH对酒精体积分数的影响Fig.1 Effect of initial sugar content and initial pH value on the alcoholicity

从图1可以看出，随着初始糖度的升高酒精体积分数先上升后下降，不受初始pH的交互作用的影响。初始糖度和接入乳酸菌时间对酒精体积分数的影响，见图2。可以看出，初始糖度对酒精体积分数的影响受接入乳酸菌时间的交互作用的影响，较早接入乳酸菌时，酒精体积分数随初始糖度的升高而降低；较晚接入乳酸菌时，初始糖度升高，酒精体积分数升高。

初始糖度和混合接种量对酒精体积分数的影响，见图3。

图2 初始糖度和接入乳酸菌时间对酒精体积分数的影响Fig.2 Effect of initial sugar content and the time that inoculate lactobacillus on the alcoholicity

图3 初始糖度和混合接种量对酒精体积分数的影响Fig.3 Effect of initial sugar content and inoculating amount of mix-fermentation on the alcoholicity

由图3可知，初始糖度对酒精体积分数的影响受混合菌种接种量交互作用的影响，混合菌种接种量较低时，酒精体积分数随初始糖度升高而降低；混合菌种接种量较高时，初始糖度升高，酒精体积分数升高。

初始pH和接入乳酸菌时间对酒精体积分数的影响，见图4。

图4 初始pH和接入乳酸菌时间对酒精体积分数的影响Fig.4 Effect of initial pH value and the time that inoculate lactobacillus on the alcoholicity

由图4可知，初始pH对酒精体积分数的影响受接入乳酸菌时间的交互作用的影响，较早接入乳酸菌时，酒精体积分数随初始pH的升高而升高；较晚接入乳酸菌时，初始pH升高，酒精体积分数降低。

初始pH和混合接种量对酒精体积分数的影响，见图5。

图5 初始pH和混合接种量对酒精体积分数的影响Fig.5 Effect of initial pH value and inoculating amount of mix-fermentation on the alcoholicity

从图5可以看出，随初始pH的升高酒精体积分数先升高后下降，不受混合菌种接种量交互作用的影响。接入乳酸菌时间和混合接种量对酒精体积分数的影响，见图6。

从图6可以看出，接入乳酸菌时间对酒精体积分数的影响受混合菌种接种量的交互作用的影响。

图6 接入乳酸菌时间和混合接种量对酒精体积分数的影响Fig.6 Effect of the time that inoculate lactobacillus and inoculating amount of mix-fermentation on the alcoholicity

2.2.3 工艺优化和验证性试验

由回归方程确定的最优工艺条件为：初始糖度19.31 °Bx，初始pH4.41，酵母单独发酵26.06 h后接入乳酸菌，混合接种量8.34%，在此条件下成品酒酒精体积分数的最大预测值为21.64%。考虑实际操作性，将发酵工艺参数修正为：初始糖度19.3°Bx，初始pH4.4，酵母菌单独发酵26 h后接入乳酸菌，混合接种量8.3%。在此条件下进行验证试验，成品酒酒精体积分数为20.8%，符合率达96.12%，说明优化工艺的模型有效。

2.3 成品酒质量指标

2.3.1 感官指标

清亮透明；有纯正、清雅、和谐的乳香和酒香；绵甜醇和，无异味；具有本品突出的风格。

2.3.2 理化指标

酒精度(体积分数)/%：15～20；总酸（以乙酸计）/（g/L）:0.3～0.6；总酯（以乙酸乙酯计）/（g/L）：0.6～0.8。

2.3.3 卫生指标

甲醇/（g/L）≤0.40；杂醇油/（g/L）≤1.50。

3 结论

采用响应面法优化蒸馏型牛奶酒发酵工艺，得出的优化工艺条件为：初始糖度19.3°Bx，初始pH4.4，酵母单独发酵26 h后接入乳酸菌，混合接种量8.3%。在此条件下，产品的酒精体积分数为20.8%。试验建立的二次回归模型对试验拟合较好。所得的成酒奶香酒香浓郁，是一种营养丰富的保健酒，开发前景广阔。

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