基于mtDNA COI序列的福建B型烟粉虱田间种群分析

郑 宇，赵建伟，何玉仙，翁启勇，黄 建

(1．福建农业科学院植物保护研究所，福建福州350013;2．福建农林大学植物保护学院，福建福州350002)

我国烟粉虱的发生记录最早始于1949年(周尧，1949)，后由于外来生物B型烟粉虱入侵，在我国严重发生是最近十多年时间(张芝利等，2001)。福建省烟粉虱暴发始于本世纪初，开始于福建南部地区，随后范围迅速扩散(何玉仙等，2005)。本课题成员于2005和2009年对福建省烟粉虱田间种群的生物型鉴定、抗药性监测表明，福建省各地区烟粉虱田间种群为B生物型。对常规化学药剂均产生了一定水平抗性，对烟碱类农药抗性发展尤为迅速。通过抗药性不同影响因子分析证实了化学药剂胁迫是烟粉虱抗药性水平迅速发展的关键因子(何玉仙等，2007;郑宇等，2012)。而不同的药剂选择压力(胁迫)是影响昆虫抗药性水平差异的一个重要原因(唐振华等，1999)。杀虫剂胁迫又可能导致种群遗传变化，这是由于抗性个体迁移导致种群间基因交流、种群遗传结构发生变化。臧连生等(2006)和Zhang等(2004)都证实入侵我国的B型烟粉虱抗性种群与敏感种群在DNA水平上已存在明显分化，不同抗性水平的烟粉虱种群其遗传结构有较大差异。

为了进一步阐明我省烟粉虱在药剂选择压力下的群体变化和进化趋势，从不同地理种群的遗传特征分析可以有助于我们从群体水平来理解和分析。而昆虫群体中的遗传变异或多态性最终都是其DNA序列的差异或多态性，通过DNA序列分析我们可以检测到序列中不同碱基替换、插入和缺失等变异信息，从而在分子水平上检测出群体及种间的多态与遗传差异。而昆虫线粒体DNA序列分析是最有效的方法之一，其中线粒体COI(mtDNA COI)基因进化速度适中，一个较短的基因片段就包含从种水平乃至科水平的系统发育信息(Moritz et al．，1987)。在国内外mtDNA COI基因已被用来研究烟粉虱的系统发育关系，该基因差异能有效反映烟粉虱生物型的地理模式，被大量用来分析烟粉虱复合种不同地理种群的遗传分化等(Frohlich et al．，1999;褚栋等，2005a、2005b、2006)。本课题主要利用的 mtDNA COI分子标记技术，通过与其它地区不同地理烟粉虱种群比较，探讨福建地区烟粉虱地理种群遗传特征，进一步了解在环境选择压力下种群遗传变异和分化趋势，为揭示烟粉虱成功入侵并暴发成灾的原因，为烟粉虱预防、可持续控制与管理提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1．1 供试虫源

从福建省8个具有代表性的地理区域采集10份烟粉虱样品，经过测序确定为B型烟粉虱后，作为测定虫源(郑宇等，2012)。挑选烟粉虱雌成虫，-20℃下用无水乙醇保存，作为烟粉虱DNA提取虫样。记录烟粉虱样品采集时间、地点和寄主(表1)。

1．2 烟粉虱DNA方法提取与检测

直接采用昆虫DNA提取试剂盒(上海生工)提取。得到的DNA用30 μL TE溶解。用Thermo核酸蛋白检测仪检测其浓度和纯度，并稀释至10 ng·μL-1低温保存待用。

1．3 PCR引物与扩增条件

所用引物和反应程序参照(罗晨，2002)，PCR产物以1．2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在伯乐紫外仪上观察，记录结果。引物 C1-J-2195(5＇TTBATTTTTTGGTCATCCAGAAGT3＇)和R2819(5＇CTGAATATCGAGGCATTCC3＇)，扩增产物大小为 600 bp 左右。

1．4 序列分析与数据处理

对样品进行了正反链测序。由DNAstar软件包对样品序列进行分析和调整。再使用DNASP5．0软件统计序列，计算单倍型多态度、核苷酸多样性;单倍型数目等。

1．5 聚类分析

基于Kimura-2-Parameter双参数模型，在Mega5．0软件中用UPGMA法构建单倍型分子系统树。

表1 不同烟粉虱种群的地点、生物型、寄主、试验个体数量以及采集时间Table 1 Sampling location，sample name，hosts and sampling time of B．tabaci collected from different places

2 结果与分析

2．1 福建群体与其它三个地理种群遗传特征分析

本实验共分析了福建烟粉虱不同地理群体10个个体，mtDNA COI序列经比对目的片段长为592 bp。利用DNAsp5．0软件进行序列分析发现10个烟粉虱中共鉴定出10种单倍型，单倍型比率100．0%，单倍型多样度Hd=1．0。变异位点(variable site)为26个，变异位点比率4．39%，其中简约信息位点(parsimony information site)20个，变异比率为3．37%;核苷酸多样性 pi=0．021(表 2)。

表2 烟粉虱不同地理种群的单倍型多样性h和核苷酸多样性piTable 2 Haplotype diversity and Nucleotide diversity of different geographical populations of B．tabaci

另外从NCBI数据库中筛选出符合同一地区、同一时间、样本数较多的3个B型烟粉虱不同地理种群mtDNA COI序列，分别为埃及(EGT)，湖北(HB)和武汉(WH)，进行mtDNA COI序列比对分析。其中埃及种群6个个体共鉴定出6种单倍型，单倍型比率100．0%，单倍型多样度Hd=1．0。变异位点12个，变异位点比率1．36%，其中简约信息位点5个，变异比率0．057%，核苷酸多样性pi=0．00676;湖北种群7个个体共鉴定出2种单倍型，单倍型比率28．6%，单倍型多样度Hd=0．286。变异位点(variable site)4个，变异位点比率0．453%，其中简约信息位点0个，变异比率0%;核苷酸多样性pi=0．0015;武汉种群6个个体共鉴定出1种单倍型，单倍型比率0．0%，单倍型多样度Hd=0．0。无变异位点和变异位点比率，核苷酸多样性pi=0(表2)。结果表明无论是核苷酸多样性、核苷酸变异比率、单倍型比率、单倍型多样性，福建地区B型烟粉虱种群数值最高，表明其遗传多样性最为丰富。

2．2 不同地理种群的系统进化树

不同地理种群的UPGMA系统进化树(图1)，形成了两大枝，第一大枝由福建、武汉和湖北种群构成;第二大枝由埃及种群组成。第一枝又分为2个小组，一组由福建和武汉种群组成，另一组由湖北种群组成。从遗传距离看(表3)，埃及种群与其它3个地理种群距离最远，为1．194-1．911之间，而国内3个地理种群遗传距离比较接近，为0．005-0．202之间，种群相似度较高。以上说明埃及群体与中国三个群体的遗传背景有所不同，地理距离与群体的遗传距离存在一定的相关性。另外，福建地理种群分布在国内群体的不同分支内，说明其在群体遗传结构上较大遗传差异，有更为丰富的遗传多样性。

表3 烟粉虱四个不同地理种群的遗传距离Table 3 The genetic distance for 4 different geographical populations of B．tabaci

2．3 不同地理种群遗传变异

对4个群体的遗传结构进行分析(表4)，显示60．9%的遗传差异来自于群体间，39．1%的遗传差异来自于群体内，差异极显著(P=0．000)。

表4 烟粉虱四个群体内和群体间的变异Table 4 Variation among populations and within 4 geographical populations of B．tabaci

3 讨论

本文通过对福建B型烟粉虱不同田间种群的mtDNA COI进行测序，并与其它地理B型种群比较，结果在核苷酸多样性、单倍型比率、单倍型多样度等方面，福建烟粉虱种群表现最高，说明福建田间种群的遗传多样性更为丰富，种群分化更为明显，聚类分析也表明福建地区的种群遗传结构变化较大。

我们知道烟粉虱自然种群遗传结构变化受多方面条件影响，除自身群体的遗传特性外，不同生态环境条件下都可能是诱导烟粉虱遗传分化的因子。Zhang等(2005)就证实寄主植物是诱导烟粉虱遗传分化的重要因素，B型烟粉虱的遗传分化与受寄主胁迫的时间和强度成正相关。其它环境因子如温度等亦能影响其遗传分化(Zhang et al．，2005;褚栋等，2006)。这些都是烟粉虱对不同生境的适应反应，从群体上表现出不同的遗传变化。结合以往研究，近年来福建地区烟粉虱种群抗药性水平上升十分迅速，不同地理种群抗性水平差异也较大，这与不同化学药剂的施药水平和胁迫压力密切相关(郑宇等，2012)。烟粉虱在杀虫剂的选择下，抗性个体迁移导致种群间基因交流、种群遗传结构发生变化。研究证实，化学药剂的不合理使用能导致B型烟粉虱种群抗药性水平迅速提高，而其种群的遗传结构也发生快速演变和分化。臧连生等(2006)和Zhang等(2004)都证实入侵我国的B型烟粉虱抗性种群与敏感种群在DNA水平上已存在明显分化，不同抗性水平的烟粉虱种群其遗传结构有较大差异。可以推测，在福建地区烟粉虱田间种群遗传结构不可避免受到化学药剂胁迫影响，而这种影响又是深刻、长远的。

图1 由COI序列得到的UPGMA系统树Figure 1 UPGMA phylogenetic tree based on COI sequences

B型烟粉虱能够在我国成功入侵并为害巨大，除了与该种群对土著种竞争取代(Reitz and Trumble，2002)和生态环境(包括寄主植物、气候因子、越冬场所等)的适应能力密切相关外(Drost et al．，1998;张芝利，2000)，另一个重要影响因素就是B型烟粉虱抗药性水平在其入侵、扩散过程中也起到了重要的作用(Byrne et al．，2000;Riley and Tan，2002)。结合我省烟粉虱种群抗药性监测和抗药性水平发展的情况(何玉仙等，2007;郑宇等，2012)，可以推测在环境胁迫下，如杀虫剂压力选择下，我省田间烟粉虱种群开始出现比较明显的抗性遗传分化，以适应不利环境，这对今后我省烟粉虱防治工作是一个重要警示。

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