小叶女贞叶片提取物药用活性研究

倪建成，吕述权，丁 骁，谭庆伟

(1．福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建福州350002;2．福建农林大学植物病毒研究所，福建福州350002)

小叶女贞(Ligustrum quihoui Carr．)又名小白蜡，为木犀科(Oleaceae)女贞属(Ligustrum)植物，主要分布于我国华北、华中和西南地区。其叶入药，具清热解毒等功效，治烫伤、外伤，树皮入药治烫伤。近年来的研究表明，小叶女贞提取物具有显著的增强机体免疫力、止咳平喘及清除自由基等作用(韩兆东等，2008;邱世翠等，2003;杨肇亨等，1996;徐向田，2009;洪新，1995)。

1 材料与方法

1．1 试验材料

小叶女贞叶采自福建农林大学校园，经福建农林大学植保学院欧阳明安研究员鉴定;铜绿假单胞菌PAO1由中科院城市环境研究所馈赠;人肝癌细胞系BEL-7404由福建协和医院肝胆研究所提供。

1．2 试验方法

1．2．1 小叶女贞叶片提取物的制备及初步分离 干燥小叶女贞叶片(5 kg)，采用煎煮法，煮沸30 min，取煎煮液合并，减压浓缩得到粗提物。将粗提物用适量水溶解，采用大孔吸附树脂D101除糖后，通过干柱层析(100-200目硅胶，氯仿/甲醇/水=8:2:0．2)，TLC检测合并相同流分得到 Fr．1-Fr．6 共 6 个组分。

1．2．2 抗菌活性检测 将小叶女贞叶片提取物用MH培养基稀释成不同浓度的供试溶液，过滤除菌后，4℃密封保存，备用。采用微量肉汤稀释法，参考NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，对小叶女贞叶提取物抗菌活性进行评价。以在孵育24 h和48 h小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度分别为MIC和MBC。

1．2．3 体外细胞毒性测定 采用MTT法(Twentyman PR et al．，1989)测定样品对人肝癌细胞系BEL-7404增殖的抑制作用。将小叶女贞叶片提取物用细胞培养液配制成不同浓度的溶液，每样品6个重复，设置阳性对照(5-Fu，50 g/mL)，阴性对照(单细胞悬液)和空白对照(细胞培养液)。用酶标仪测定570 nm波长下吸光值，并计算抑制率，参照如下公式:

抑制率%=［1-(OD处理-OD空白)/(OD对照-OD空白)］×100

其中OD处理为处理组吸光度的平均值;OD对照为阴性对照组吸光度平均值;OD空白为空白对照组吸光度平均值。

1．2．4 DPPH自由基清除作用的检测 DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇水溶液呈很深的蓝紫色，在517 nm处有强吸收，其颜色的变化随被清除的程度而变化，通过测量517 nm处的吸光度可以动态监测DPPH自由基被清除的效果。

根据 Jamila等方法(Jamila HS et al．，2011)，称取3．9 mg DPPH，加入100 mL无水乙醇配成0．1 M DPPH溶液;取洁净的并作避光处理的10 mL离心管，样品组加入1 mL不同浓度的样品溶液和1 mL的DPPH溶液，阴性对照为2 mL的DPPH溶液，空白对照为2 mL的含样品溶剂，以相同体积的抗坏血酸(VC)溶液代替待测样品阳性对照组，每样品6次重复;将离心管置于恒温振荡培养箱避光振荡，然后通过酶标仪测定517 nm处的吸光度。

DPPH清除率%=(1-OD处理/OD空白)×100

其中OD处理为不同浓度各组分处理吸光度的平均值;OD对照为阴性对照组吸光度的平均值;OD空白为空白对照组吸光度的平均值。

2 结果与分析

2．1 抗菌活性

小叶女贞对铜绿假单胞菌PAO1有一定的抑制作用，12 h内，5 mg/mL即可抑制其生长;24 h后，8 mg/mL浓度时，肉眼可见没有细菌的生长，可表明小叶女贞对铜绿假单胞菌PAO1的MIC为8 mg/mL。经过36 h和48 h的培养后，9 mg/mL时，细菌的生长继续受到抑制，由此可以得出，小叶女贞粗提物溶液的MBC为9 mg/mL。

对小叶女贞叶片提取物初步分离得到的各组分Fr．1-Fr．6进行抗菌活性检测，结果(表1)表明，培养12 h，2 mg/mL浓度处理下，Fr．1表现出抑菌活性，其余部分都有菌生长;培养24 h，Fr．1 在4 mg/mL 时有抑菌活性，MIC 为4 mg/mL;培养36 h，Fr．1 在6 mg/mL 表现出抑菌活性，其余部分都丧失抑菌活性;培养48 h，Fr．1在6 mg/mL仍表现出抑菌活性。由此确定了小叶女贞对铜绿假单胞菌PAO1的抑制活性组分为低极性组分Fr．1。

2．2 抗肿瘤活性

采用MTT法测试小叶女贞叶粗提物和以及初步分离得到的6个组分 Fr．1-Fr．6 对人肝癌细胞 BEL-7404细胞毒活性。结果(图1)表明，粗提物对人肝癌细胞BEL-7404体外增殖具有明显的抑制作用，供试浓度0．6 mg/mL时，抑制率仍达到94．2%，但在 0．4 mg/mL 剂量下抑制效果减弱，抑制率为62．9%。

表1 小叶女贞提取物各组分对铜绿假单胞菌PAO1抑菌作用Table 1 Antibacterial effect of Fr．1-Fr．6 against PAO1

Fr．1 显示出较高的活性(图2)，在 0．4 mg/mL 剂量下，抑制率为91．3%，在0．2 mg/mL 剂量作用下，抑制率仍达到87．8%，同等条件作用下，阳性对照(50 μg/mL的5＇-Fu)抑制率为95．1%。上述结果显示，小叶女贞叶片提取物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖活性，对其活性组分有必要进一步研究。

图1 小叶女贞叶片粗提物细胞毒活性(BEL-7404)Figure 1 Cytotoxicity of aqueous extract of Ligustrum quihoui leaves

图2 小叶女贞不同组分细胞毒活性(BEL-7404)Figure 2 Cytotoxicity of Fr．1-Fr．6 against BEL-7404

2．3 抗氧化活性

设置浓度梯度，分别测定VC、小叶女贞粗提物及各部分对DPPH自由基的体外清除作用，实验结果表明(图3)小叶女贞粗提物具有较高的DPPH自由基清除能力，同阳性对照VC相比，小叶女贞粗提物清除率略低于 VC，但随着浓度的增加，两者清除率几乎相当，在500 μg/mL时，清除率在96%左右(VC为96．6%，小叶女贞叶片提取物为95．4%)。

干柱层析得到的小叶女贞各组分对DPPH自由基仍保持较高的清除活性(图4)，在250 μg/mL时，Fr．1、Fr．2、Fr．3、Fr．5、Fr．6 清除率分别 89．5% 、88．9% 、92．7% 、92．9% 、93．6%;在 50 μg/mL时，Fr．1、Fr．2、Fr．3、Fr．5、Fr．6 清除率分别 87．3% 、84．3% 、88．1% 、85．0% 、32．5% ，除了Fr．6清除率下降之外，其他组分基本上与同浓度的粗提物相当。结合相关文献以及上述结果可推测，小叶女贞对DPPH自由基具有清除作用的活性物质为多种化合物，一种可能是不同结构类型的化合物，另一种是同种结构类型的不同衍生物，并且相互之间可能会有相互协同作用。

图3 小叶女贞粗提物和VC清除DPPH自由基作用Figure 3 DPPH free radical scavenging activity of VCand leave extract from Ligustrum quihoui

图4 小叶女贞不同组分对DPPH自由基清除能力Figure 4 DPPH free radical scavenging activity of Fr．1-Fr．6

3 小结与讨论

女贞属植物作为中药应用已有2000年的历史，实载于《神农本草经》我国民间常采其鲜嫩枝叶捣烂敷于伤口上，以防止感染。现代诸多研究发现，女贞属植物多种次生代谢产物具有不同的药用活性，如齐墩果酸、熊果酸(三萜类化合物)具有抗肿瘤活性，橄榄苦甙等具有利尿作用，一些裂环环烯醚萜类和黄酮类具有抗氧化活性。

本研究证实小叶女贞叶片提取物具有抗菌、抗肿瘤以及抗氧化作用，有必要对其活性成分进行分离鉴定;并且通过对粗提物粗分和活性跟踪测试初步确定了小叶女贞的药理活性组分，这为我们进一步研究其活性成分提供了依据。

韩兆东，阮月芹，宋月雁，侯佃臻，孙丰润，孔祥华．2008．小叶女贞对免疫功能损伤小鼠T淋巴细胞免疫功能的调节作用．滨州医学院学报，31(4):258-261．

洪新，杨肇亨，周向东．1995．小叶女贞提取物-M2自由基清除剂作用的实验研究．第三军医大学学报，17(4):341-342．

邱世翠，孙丰润，韩兆东，张群，王志强．2003．小叶女贞对小鼠骨髓细胞增殖和IL-1的影响．中国中医药科技，10(4):230-231．

徐向田．2009．复方小叶女贞茶调节大鼠血脂和影响动物体重实验研究．中华中医药学刊，27(8):1749-1750．

杨肇亨，周向东，洪新，段绪伟，谢义霞，王志强．1996．静脉注射小叶女贞提取物M2对67例慢性阻塞性肺疾患患者的止咳、平喘作用分析．第三军医大学学报，18(2):138-139．

Jamila HS，Isabelle C，Christelle HS，Cédric P，Michel F，Catherine H．2011．Biological activities of flavonoids from Nitraria retusa(Forssk．)Asch．and their acylated derivatives．Food Chemistry，124:486-494．

Twentyman PR，Fox NE，Rees JK．1989．Chemosensitivity testing of fresh leukemia cells using the MTT colorimetric assay．British Journal of Haematology，71:19-22．