淫羊霍苷对去卵巢骨质疏松症雌鼠的疗效及机理初步研究＊

刘仕杰，莫新民△，李劲平，杨 军，张小君

(1.湖南中医药大学，长沙 410007;2.中南大学药学院，长沙 410013)

壮骨止痛方是本课题组开发的治疗骨质疏松症的新药，对绝经后骨质疏松症有良好疗效［1］。课题组在确定复方有效部位的基础上［2］，从其无水乙醇部位分离制备了淫羊霍苷，通过药效学试验证明淫羊霍苷是其有效成分之一。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与饲料 3月龄SD雌性大鼠40只，体重250g左右，SPF级。饲料为标准普通饲料。动物和饲料均由湖南中医药大学实验动物中心提供(动物许可证号SCXK(湘)2009-0004)。

1.1.2 药品与试剂 壮骨止痛方(原材料购自九芝堂，由中南大学药学院制备)，淫羊霍苷(由中南大学药学院制备，纯度99.99%)，雌激素(HY-032)放免试剂盒(北京华英生物技术研究所)。

1.1.3 主要仪器 Unigamma骨密度仪(意大利)，JY3002型电子天平，低温离心机，LEICA DM LB2型双目显微镜，超低温冰箱，WDW-1000Ⅲ微机控制电子式万能实验机，MIAS医学图像分析系统，Motic B5显微摄像系统和GC-1500r放射免疫计数器等。

1.2 方法

1.2.1 分组 大鼠适应性饲养1周，按体重随机分为假手术组10只，其他30只大鼠造模，术后1周将模型大鼠按体重随机分为模型组、壮骨止痛方组和淫羊霍苷组，共4组。

1.2.2 造模方法［3］采用公认的成年雌性大鼠去卵巢3个月绝经后骨质疏松症病理模型。造模方法:2%戊巴比妥钠(0.2ml/100g体重)麻醉，在无菌的条件下从距离大鼠胸腰椎外侧1cm处纵向切开皮肤及两侧肌肉，摘除双侧卵巢，假手术组仅在卵巢周围切除相应体积的脂肪，分两层缝合伤口并用生理盐水擦洗干净血迹，术后连续3d大腿肌肉注射青霉素钠，每只大鼠4万u/d，术后5d拆线，饲养于室温23℃ ～25℃、相对湿40% ～60%的清洁环境中，自由摄食和摄水。

1.2.3 给药方法 各组均从拆线后开始给药，每天灌胃1次，连续13周。假手术组和模型组每天灌胃相应体积的冷开水和油中王牌植物油，壮骨止痛方组灌药(水相 0.25ml/100g·d，油相 0.75ml/100g·d)，淫羊霍苷组灌药(水相0.4ml/100g·d，油相0.6ml/100g·d)。剂量按各药效相关物质相对壮骨止痛方的得率及人鼠体表面积折算确定。

1.2.4 指标检测 连续灌胃13周，每10d称1次体重，13周之后所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(0.2ml/100g)，麻醉后腹部切口分离腹主动脉，用负压采血管血 8ml，静置 2h ～3h，3000r/min 离心15min后分离血清，以备放射免疫法检测相关指标。剖取左右后肢完整的胫骨及第2～4腰椎，去除上面附着的肌肉组织保留骨膜并做相关检查。

血清E2检测:(1)放射免疫法检测血清 E2;(2)骨密度检测:取第2～4腰椎骨用湿纱布包裹，送湖南中医药大学附一院骨密度室检测骨密度;(3)骨生物力学检测:取右胫骨分干净肌肉，用湿纱布包裹送国防科技大学物理系检测骨最大抗弯曲强度;(4)骨组织病理学检测:取左侧胫骨用4%的多聚甲醛固定48h，然后用5%的硝酸脱钙1周，送湖南中医药大学病理检验中心检测胫骨的病理组织学形态变化，测量平均骨小梁密度。

1.2.5 统计方法 数据处理采用SPSS16.0统计软件进行方差分析和Q检验，实验数据以平均值±标准差(±s)表示，P＜0.05具有显著性差异。

2 结果

2.1 对去卵巢雌性骨质疏松模型大鼠血清E2的影响

表1 对去势骨质疏松大鼠血清E2的影响

表1显示，淫羊藿苷组与模型组相比明显升高，差异具有显著性意义(P＜0.05)。

2.2 对去卵巢雌性骨质疏松模型大鼠骨密度的影响

表2 对去势骨质疏松大鼠骨密度的影响

表2显示，淫羊霍苷组腰椎骨密度与模型组相比明显升高，差异有显著性意义(P＜0.05)，与壮骨止痛方组比较无显著差异性(P＞0.05)。

2.3 对去卵巢雌性骨质疏松模型大鼠右胫骨骨生物力学的影响

表3 对去势大鼠骨生物力学的影响

表3显示，与模型组相比，淫羊霍苷组有提高右胫骨最大抗弯曲强度的趋势，但无差异性(P＞0.05)。壮骨止痛方组能够显著提高右胫骨的最大抗弯曲强度(P＜0.01)，提高骨生物力学性能。

2.4 对去卵巢雌性骨质疏松症大鼠左胫骨骨组织形态学的影响

表4 对去势大鼠左胫骨骨小梁密度的影响

表4显示，在10×40倍镜下，通过显微形态学计算机网络系统测量骨小梁的密度，每张切片取5个视野，取其平均值。

病理切片表明，假手术组骨小梁分布均匀，股骨颈梁髓比正常。去卵巢模型组骨小梁稀疏、破坏，髓腔扩大，梁髓比下降，说明壮骨止痛方组和淫羊霍苷组能提高骨小梁的分布和梁髓比。

图1 大鼠左胫骨骨组织病理切片

3 讨论

绝经后骨质疏松症属于高代谢转换型，即破骨细胞的骨吸收活动增强，骨吸收大于骨形成，因此绝经后骨质疏松症发病机制的中心环节是破骨细胞数量的增加。淫羊藿苷是淫羊藿中含量最为丰富的黄酮苷类化合物，大量实验表明，淫羊藿苷具有抑制破骨细胞活性、增强成骨细胞活性的作用。有研究表明［4］，淫羊藿苷可明显改善骨质疏松模型小鼠的骨形态计量学指标。实验证明［5］，通过采用MTT法做淫羊藿苷对离体人成骨细胞增殖的研究发现，不同浓度的淫羊藿苷对成骨细胞的生长增殖均有促进作用，从而得出结论淫羊藿苷在促进成骨细胞增殖的同时，增强了成骨细胞成骨活性。

本实验中，模型组和假手术组相比较，血清E2和腰椎骨密度明显下降，差异有显著性(P＜0.05)，骨小梁稀疏、破坏，髓腔扩大，梁髓比明显下降，差异显著(P＜0.05)，右胫所能承受的最大压力下降，差异显著(P＜0.05)，说明大鼠去卵巢后不仅有骨量的减少，还有骨强度的下降，这些特征与绝经后骨质疏松的生理改变类似，说明本实验中的病理模型复制成功。

给药后与模型组相比，淫羊霍苷组血清E2增高和骨密度增加明显(P＜0.05)，骨小梁密度显著提高(P＜0.05)，提高了骨小梁的分布和梁髓比，说明淫羊霍苷能有效地抑制去势后骨量的丢失。骨生物力学性能未见显著提高(P＞0.05)，但从结果分析有提高的趋势，说明淫羊藿甘对绝经后骨质疏松具有良好的疗效。

雌激素的减少可导致相应的免疫功能自稳平衡被破坏，激活和增殖T细胞，促进破骨细胞的形成。雌激素缺乏时，巨噬细胞集落刺激因子、破骨细胞分化因子表达增加，T细胞增多，肿瘤坏死因子、白介素1产生增多，破骨细胞分化增殖增多，生存期延长，骨吸收增强，同时成骨细胞凋亡增多，骨形成不足以代偿骨吸收，使骨量减少，骨小梁变细，小梁间隙增宽，发生骨质疏松［6］。胸腺缺如的T细胞缺乏的小鼠与正常小鼠比较，去卵巢术后(ovariectomy，OVX)不伴有破骨细胞的增加，胸腺缺如对OVX诱导的骨量减少和骨转换指标的增加有保护作用。TNF-α-/-的OVX小鼠不发生骨量减少，而将野生型小鼠的T细胞移植给胸腺缺如的小鼠可恢复OVX诱导的骨量减少，但自 TNF-α-/-小鼠移植的 T细胞则不能恢复OVX诱导的骨量减少，提示T细胞介导了雌激素缺乏对破骨细胞的刺激作用以及对骨重建的作用［7］，这说明雌激素缺乏所导致的骨质疏松症是通过T细胞来发挥作用的，T细胞对破骨细胞的形成具有主导作用。

本实验提示，淫羊霍苷具有明显提高血清E2的含量，具有差异性(P＜0.05)，其治疗绝经后骨质疏松症的作用机制可能是通过调节体内雌激素水平，从而调节巨噬细胞向破骨细胞的转化而发挥作用，具体过程还有待更进一步的研究。

［1］莫新民，曾 英，彭琼辉，等.壮骨止痛胶囊治疗去卵巢雌鼠骨质疏松症疗效的实验研究［J］.中国中医基础医学杂志，2007，13(3):195-198.

［2］甘国兴，莫新民，李劲平，等.壮骨止痛方药效部位的筛选及其对骨质疏松雌鼠骨代谢相关激素的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(15):126-130.

［3］魏玉芳，王长海，刘钰林，等.补肾法对大鼠绝经后骨质疏松模型的影响［J］.第四军医大学学报，2007，28(6):544-545.

［4］张金娟，文 娱，张贵林，等.淫羊藿苷对骨质疏松模型小鼠骨组织形态计量学指标的影响［J］.贵州医药，2010，34(5):404-405.

［5］于 波，杨久山，刘 岩，等.淫羊藿苷对人成骨细胞的作用［J］.中医正骨，2006，18(6):17-18.

［6］邢小平，王 鸥，韩桂艳.代谢性骨病与免疫［J］.临床内科杂志，2007，24(3):149-152.

［7］Cenci S，Weitzmann MN，Roggia C，et al.Estrogen deficiency induces bone loss by enhanceing Tcell production of TNF-α［J］.J Clin Invest，2000，106:1229-1237.