反应器细胞悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产中的应用

张 韧，王建超，陈文庆，刘华杰，高 飞，徐舸辰，林龙飞

(北京清大天一科技有限公司，北京 102200)

在我国，细胞反应器悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产领域的研发和应用正成为行业技术革新、产业升级的重要内容。农业部公告第1708号中明确规定，自2012年2月1日起，各省级兽医行政管理部门停止对转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目的兽药GMP验收申请。本文就反应器细胞悬浮培养和微载体培养技术在口蹄疫疫苗和禽流感疫苗生产中的国内外应用和发展情况进行了综述，分析了动物疫苗产业发展趋势和我国疫苗产业技术升级所面临的机遇和挑战。

1 反应器悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用

口蹄疫被认为家畜传染性疾病中传染性最强的一种疾病，国际兽医局(OIE)将之列为A类传染病。2010和2011年，在亚洲、非洲都有口蹄疫局部的爆发。接种安全、高效的疫苗是预防口蹄疫疫情发生的最有效策略之一。通常主要是通过浓缩技术提高口蹄疫疫苗的有效抗原量来实现其高效性;通过病毒纯化工艺、有效的病毒灭活工艺来保证疫苗的安全性。反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒能显著提高口蹄疫病毒抗原浓度。国际上先进的口蹄疫疫苗的生产工艺都采用反应器悬浮培养BHK21细胞技术、有效的病毒纯化工艺及二次病毒灭活工艺。当前，面对国内外严峻的口蹄疫防控形势，高质量的口蹄疫疫苗必将在口蹄疫防控中发挥关键作用。

1.1 国外应用现状和发展趋势 BHK21细胞是繁殖口蹄疫病毒的理想宿主。20世纪60年代，许多国家实验室建立起了转瓶培养BHK21细胞繁殖口蹄疫病毒的生产系统［1］。1962年BHK21细胞悬浮培养成功，细胞增殖迅速，并成功应用于口蹄疫病毒的生产［2］。反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒也就成为最普遍的口蹄疫疫苗生产方式，主要集中在印度、土耳其、巴西、阿根廷等国家［3］(表1)。印度口蹄疫生产企业使用8000 L反应器生产口蹄疫疫苗，南美口蹄疫疫苗生产企业一般采用3000～5000 L反应器生产口蹄疫疫苗，口蹄疫病毒抗原146S浓度大约在2 μg/mL。因为口蹄疫疫苗保护力与146S有正相关性，这些企业根据口蹄疫病毒146S来配制疫苗有效地保证了疫苗的质量。

表1 国外部分悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗企业及其生产工艺

但是，这种20世纪60年代开发的口蹄疫疫苗生产工艺延续至今，存在许多技术上的缺陷。国外口蹄疫疫苗生产使用的BHK21细胞培养液是添加磷酸肉汤(Tryptose phosphate broth，TPB)或水解乳蛋白(Lactalbumin hydrolysate，LAH)的 GMEM及EMEM，再补加5% ～10%牛血清(表1)。不同批次间血清质量差异引起细胞培养效果不稳定，导致影响疫苗生产工艺的稳定性和疫苗质量。疫苗中残留的血清蛋白使接种动物过敏反应升高，一定程度上影响疫苗的安全性。在口蹄疫强制免疫的国家，牛血清中存在含有抗口蹄疫病毒抗体的可能性，不仅影响病毒繁殖，而且可能导致口蹄疫病毒在抗体压力下选择性变异。牛血清中潜在污染朊病毒或疯牛病病毒可给动物疫苗带来潜在的生物危害，TPB或LAH等动物来源成份也存在安全隐患。为提升产品质量及安全性，目前国外多数口蹄疫疫苗生产厂家急于将现使用的含血清生产工艺升级为不含血清生产工艺。

自从20世纪的80年代起，细胞培养基(液)发展迅速，低血清细胞培养基、无血清细胞培养基、无血清无动物来源成分细胞培养基已商品化，为疫苗生产中少使用或不使用血清奠定了物质基础。

1.2 国内应用现状 2008年，默克密理博北京清大天一科技有限公司(以下简称“清大天一”)在国内开发了BHK21低血清细胞培养基及反应器悬浮培养BHK21技术，并于2009年成功应用到国内一家口蹄疫疫苗生产企业中。使用该工艺生产的口蹄疫抗原146S浓度可以达到3 μg/mL左右。该工艺全过程管道化操作，产品内毒素含量低，口蹄疫疫苗生产和质量显著提高，同时生产成本下降30%［4－8］。

2009年，该公司成功开发了BHK21无血清无动物来源成分培养基和反应器无血清悬浮培养BHK21细胞技术，并2010年成功应用到国内某口蹄疫生产企业。相比于含血清悬浮培养工艺，无血清悬浮培养工艺具有巨大的技术优势。从种子库复苏BHK21细胞开始，到口蹄疫病毒繁殖、直至收获的全过程，不添加任何的血清和动物来源成分，消除了血清抗体对病毒繁殖的干扰，同时减轻了纯化压力。无血清悬浮培养BHK21细胞的细胞密度可以达到5×106～6×106/mL以上，为生产高浓度口蹄疫疫苗奠定了技术基础。

图1是反应器无血清培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒的工艺流程图，相比于含血清口蹄疫病毒生产工艺，因实现细胞无血清培养，工艺过程无需沉降换液。

图1 4000L反应器无血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺流程

目前国内某企业使用该工艺生产的口蹄疫疫苗正处于报批阶段，其他多家口蹄疫疫苗生产企业及研究单位也在研发或寻求无血清悬浮培养生产口蹄疫疫苗的工艺。

2 反应器细胞培养技术在禽流感病毒疫苗生产中的应用

50多年来，用鸡胚生产禽流感疫苗的方法一直沿用至今，基本流程是将新的流感病毒株与适宜鸡胚扩增的标准实验室毒株重配，制备并验证疫苗株，随后进行疫苗株的生产条件优化和疫苗批量生产，这个过程约需要22周以上的时间［9］。鸡胚禽流感工艺简单、成熟，但存在缺陷:需要提前准备高质量的受精鸡胚，鸡胚来源容易受到禽流感疫情的影响;单个受精鸡胚通常生产一剂疫苗，效率较低，难以在短时间内大规模生产;为提高产量，需要进行疫苗株驯化过程［10］。正因如此，著名的市场调查资讯公司GBI Research在2011年发表研究报告指出，采用鸡胚生产流感疫苗工艺将逐渐被细胞培养生产工艺代替［11］。

采用反应器培养细胞生产流感疫苗的过程大概需要12周时间［9］，发生突发疫情时，将细胞库中冻存的细胞复苏，细胞快速增殖进入规模化生产疫苗，在生物安全三级环境下可以直接应用野毒流行株进行疫苗生产。现已发现MDCK、Vero等细胞对禽流感或流感病毒敏感，经过工艺优化，病毒滴度或HA效价并不低于鸡胚。同时，反应器细胞培养工艺生产流感疫苗的安全性和有效性，已有多种流感疫苗被美国FDA和欧洲EMEA批准上市(表2)［12－14］。细胞培养生产线自动化程度高，更容易疫苗的质量控制。如，流水线管道化无菌生产、无外源因子污染;无卵清蛋白、易于纯化;产品批间差小、纯度高、安全性高。

表2 部分利用细胞培养系统进行流感疫苗生产(研究)的企业

2.1 国外应用现状 国际上应用反应器微载体培养技术生产流感病毒生产的哺乳动物细胞主要有Vero细胞、MDCK细胞;用反应器全悬浮培养技术生产流感病毒主要有PER.C6细胞、MDCK 33016细胞和AGE1.CR细胞。其中，美国百特生物科技公司(Baxter)的6000 L反应器微载体培养Vero细胞生产流感疫苗的平台是一个非常成功的案例，能生产人或禽来源的 H1、H2、H3、H5、H7 和 H9 等各亚型毒株，对野生型的人H5N1病毒则有更高的生产效率［15］。其工艺流程:复苏细胞库的Vero细胞，经方瓶和转瓶扩增种子细胞，接种至生物反应器中，经过反应器逐级放大至6000 L反应器，控制细胞密度在2×106～3×106/mL，按一定的病毒感染复数(Multiplicity of infection，MOI)接种病毒，病毒吸附l h后加入胰酶，32～35℃孵育48～72 h后收获病毒液。

2.2 国内应用现状 国内禽流感疫苗或流感疫苗的生产工艺均采用鸡胚生产工艺。国内已有多家单位正在开发MDCK细胞、Vero细胞生产禽流感病毒疫苗工艺。因为PER.C6细胞、MDCK 33016细胞和AGE1.CR细胞都存在专利保护及许可使用等问题，应用微载体培养MDCK细胞、Vero细胞成为一种现实的选择。但对于禽流感病毒疫苗，至少1000 L规模以上的生物反应器用于生产病毒，该禽流感疫苗才有市场价值。采用生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗工艺过程中最大的困难是反应器微载体培养细胞的逐级放大技术的开发。

清大天一自2009年开始进行反应器微载体放大技术的研发工作，并于2011年获得成功，实现了微载体培养细胞从10L–50L–120L–650L反应器逐级放大培养MDCK细胞(图2)、Vero细胞以及Marc145细胞、ST细胞等。

图2 10L反应器微载体培养MDCK细胞(100×)

筛选具有良好免疫原性又能在动物传代细胞上繁殖的毒株也是禽流感疫苗生产工艺升级中的一个关键技术。国内以高校、生物制品研究所等为首对该部分有较多的研究。目前，国内禽流感病毒疫苗研究单位与微载体悬浮培养细胞工艺开发企业进行合作，在悬浮培养MDCK细胞生产禽流感病毒疫苗的工艺开发中已取得一定成果。同时清大天一与禽流感疫苗研发单位进行合作，采用cytodex－1微载体培养H5N1禽流感病毒，通过优化工艺，H5N1的血凝(HA)效价能稳定可达29以上，反应器微载体培养的MDCK在接种H5N1禽流感72 h后的细胞大部分细胞已病变、脱落(图3)。

图3 感染禽流感病毒72hr的MDCK细胞(100×)

这些关键工艺技术的突破将为反应器培养细胞生产禽流感疫苗的产业化奠定了良好的技术基础。

3 展望

从疫苗和悬浮培养的发展趋势来看，反应器悬浮培养动物细胞技术、无血清细胞培养技术等是当前世界范围内各大生物公司工业化生产疫苗的首要选择。这些工艺技术的在疫苗生产中应用不仅能提高细胞高密度和疫苗抗原产量，而且规模化、自动化的反应器疫苗生产平台有效保证每批疫苗质量的稳定性和可靠性。疫苗产品的竞争实质是不同生物制药企业在其核心技术基础上的疫苗质量之争，谁在未来掌握了反应器疫苗生产工艺技术以及生产平台，提高了效力和安全性等疫苗质量，谁将会在下一轮行业发展中掌握市场主动权。过去几年，我国动物疫苗生产企业应用反应器细胞悬浮培养技术研发或生产口蹄疫、禽流感等疫苗方面发展迅速(表3)，这表明以反应器工艺技术创新为基础的疫苗质量升级序幕已经开始。

“建立疫苗和抗体的大规模和快速反应生产新技术，系统的疫苗效果及质量评价技术体系”是我国《十二五生物技术发展规划》中的发展重点之一。反应器细胞培养工艺技术的革新是我国兽用生物制品行业升级换代的必然趋势。口蹄疫、禽流感等动物疫苗生产技术升级正是当时，通过应用和发展反应器悬浮培养技术，甚至是无血清细胞培养技术生产疫苗，将不仅能提高我国疫苗质量，有效地发挥疫苗在我国防控政策中基础性作用，而且对推动我国从疫苗生产大国走向疫苗生产强国都有着重要的示范作用和社会意义。

表3 反应器悬浮培养技术在我国动物疫苗生产中的应用概况

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