eNOs基因T786C多态性与原发性高血压的关系*

梁蓉王伟

原发性高血压的发生具有复杂性和多源性，受环境和遗传因素的共同影响。随着遗传学和分子生物学技术的发展，对原发性高血压的病因研究进入到了分子阶段，高血压发病的基因因素成为国内外研究的热点，内皮型一氧化氮合酶（eNOs）基因对血压调节的作用目前很受关注。本文通过研究eNOs基因T786C多态性与原发性高血压的相关性，旨在从分子水平探讨原发性高血压的发病机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2003年6月—2004年6月入住我院的原发性高血压患者266例（高血压组）。其中男135例，女131例，平均年龄（49.89±8.74）岁。所有患者均符合1999 WHO/ISH高血压诊断标准：在未服用抗高血压药的情况下收缩压≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），或（和）舒张压≥90 mm Hg，且至少3次非同日血压达到以上标准；或已确诊为高血压且正在服用抗高血压药物者。排除继发性高血压、凝血功能异常性疾病、血栓性疾病、脑血管疾病、外周血管性疾病、风湿性瓣膜病、先天性心脏病、心肌病及心力衰竭者。同时选取在我院体检的健康人群100例为对照组，其中男50例，女50例，平均年龄（48.05±8.04）岁，其本人和一级亲属均无原发性高血压、2型糖尿病、心脑血管病或内分泌代谢疾病。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 所有受试者入院后空腹12 h抽取肘正中静脉血4 mL，常规测定生化及凝血功能等各项指标。并纪录其身高、体质量、入院当天血压、吸烟（每日5支以上，超过5年）史及饮酒（每日饮乙醇50 g以上，超过5年）史。

1.2.2 eNOs基因T786C的PCR扩增 以提取的DNA为模板，根据设计的引物，上游5′-ATGCTCCCACCAGGGCAT CA-3′，下游5′-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3′；用PCR方法进行特异性扩增。PCR反应体系总体积为25μL，其中含模板0.5μL，引物各0.5μL，Buffer F 5μL，dNTPs 0.5μL，Taq DNA聚合酶 1.25 U。反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环，最后72℃延伸7 min。PCR产物用3%的琼脂糖电泳测定PCR扩增结果。

1.2.3 eNOs基因T786C的PCR酶切 该反应体系12.7μL，包括Buffer 1.25μL，PCR扩增产物10μL，限制性内切酶NgoM Ⅳ0.2μL，dH2O 1.25μL，37℃水浴8 h，反应终止后，用3%琼脂糖电泳分析eNOs基因T786C的基因多态性。

1.2.4 eNOS基因T786C基因型分析 受检者DNA经PCR扩增为237 bp的片段，若此片段存在786T➝C位点突变，则产生限制性内切酶NgoMⅣ的切点。酶切后得到大小为204 bp和33 bp的2个片段，为CC型；不含T➝C位点突变，酶切后只得到1个大小为237 bp的片段，为TT型；酶切后得到237、204和33 bp3个片段者，为CT型，见图1。

Figure1 Electrophotogram of eNOsgene T786Cpolymorphism图1 eNOS基因T786C多态性基因型电泳图

1.3 统计学处理 资料均采用SPSS 11.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，2组均数间比较采用t检验，多组间的计量资料比较采用单因素方差分析；计数资料采用卡方（χ2）检验，采用多因素Logistic回归分析影响高血压发病的因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组一般资料比较 高血压组的年龄、收缩压、舒张压、体质量指数及有饮酒史者均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；其他指标比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 2组eNOS基因T786C基因型和等位基因频率比较 2组TT、TC及CC基因型分布和T、C等位基因频率分布差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。

Table1 Comparison of clinical data between two groups表1 2组一般资料比较

Table 2 Comparison of eNOST786C genotype and allele frequency between two groups表2 2组eNOS基因T786C基因型和等位基因频率比较例（%）

2.3 不同eNOS基因T786C基因型患者的血压比较 因CC基因型检出率过低，故将TC、CC基因型合并为一组，为C等位基因携带组。高血压组患者中C等位基因携带者的收缩压及舒张压与TT基因型者差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

Table 3 Comparison of blood pressure in patients with T786CeNOSgenotype表3 eNOS基因T786C基因型患者血压比较（mm Hg，±s）

Table 3 Comparison of blood pressure in patients with T786CeNOSgenotype表3 eNOS基因T786C基因型患者血压比较（mm Hg，±s）

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2.4 影响高血压的多因素Logistic回归分析 以有无高血压（无：0；有：1）为应变量，以年龄、性别（女：0；男：1)、空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、纤维蛋白原、吸烟（否：0；是：1）、饮酒（否：0；是：1）、体质量指数、T786C基因型（TT型：0，CC/TC型：1）为自变量进行二元Logistic回归分析，结果显示影响高血压的因素有年龄、性别和体质量指数，见表4。

Table 4 Results of Logistic regression analysison risk factors of EH表4 高血压影响因素的多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

1980年Furchgjott等发现NO作为内皮衍生的舒张因子发挥生物学效应。一氧化氮合酶（NOs）是NO合成的限速因子。在人类基因组有3种不同的基因编码NOs，分别为内皮型NOs（eNOs）基因、诱导型NOs基因和神经元型NOs基因。它们在不同细胞的刺激下合成NO，发挥不同的作用。血管内皮细胞生成的NO扩散至血管平滑肌细胞和血流中，导致肌肉舒张、血管扩张和血流量增加，对于调节血管的张力和血压，维持动脉弹性具有重要作用[1]。其中eNOs是结构型NOs在上皮细胞的表达，在NOs基因与高血压关系的研究中，eNOs基因被予以特别关注。动物实验研究显示，该基因对血压的调节起重要作用[2-3]；抑制NOs可使健康人的血压升高。eNos基因在人类染色体上定位于7q35-q36区，大小约21 kb，含有26个外显子和25个内含子。迄今发现在eNOS基因的5′侧翼区检测到3个单核苷酸多态性位点：-1468T/A、-922A/G和-786T/C变异。

国内外许多对T786C基因多态性与原发性高血压关系的研究结果不同[4]。Nakayama等[5]研究发现T786C突变可以降低启动子的活性，从而降低eNOS基因转录起始过程的效率，使eNOS合成减少，其还发现eNos基因启动子的T786C突变减少基因的转录并与冠状痉挛性心绞痛及心肌梗死有关。为明确基因转录减少的机制，Miyamoto等[6]在Hela细胞纯化出特异地与突变等位基因结合的蛋白，这一纯化的蛋白被证实是复制蛋白A1（RPA1），其认为在T786C突变中，RPA1通过与突变等位基因结合，从而使eNOs基因转录减少。Kajiyama等[7]随后进行的T786C突变与高血压关系的研究发现高血压组与对照组的T786C突变频率相似。Tsujita等[8]对4 055例日本人研究也未发现高血压组与正常组的T786C基因型分布不同，3种基因型的血压水平也未见差异。其同时对转染-786T及-786C等位基因的牛内皮细胞研究，未发现启动子活性有显著不同。后来Hyndman等[9]研究了705例成年男性原发性高血压患者，发现eNOs的5′-侧翼区的T786C变异与EH明显相关，其认为研究结果的差异可能是不同人种的T786C突变情况不同，白人中C等位基因较普遍。

本研究结果显示高血压组与对照组TT、CT、CC基因型分布和T、C等位基因分布差别均无统计学意义，表明T786C基因多态性与高血压发生无相关性。但进一步将高血压与危险因素结合起来分析，发现血压明显受体质量指数影响。提示C等位基因可能增强了机体对某些环境因素刺激的反应，存在环境-基因相互作用，共同影响血压的水平。

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