猪骨胶原蛋白肽缓解高脂饮食诱导小鼠肝脏氧化应激的基因芯片分析

林云鉴，乐国伟*，施用晖，孙 进，李亚欣

1江南大学食品学院食品营养与功能因子研究中心;2食品科学与技术国家重点实验室，无锡214122

猪骨胶原蛋白肽缓解高脂饮食诱导小鼠肝脏氧化应激的基因芯片分析

林云鉴1，2，乐国伟1，2*，施用晖1，2，孙 进1，2，李亚欣1

1江南大学食品学院食品营养与功能因子研究中心;2食品科学与技术国家重点实验室，无锡214122

本研究探讨猪骨胶原蛋白肽降血脂作用和抑制高脂饮食诱导肝脏抗氧化应激的作用机理。40只小鼠分为5组，分别饲喂6 w正常日粮、高脂日粮、添加1.6%钙的高脂日粮、添加1%胶原蛋白肽的高脂日粮和添加1.6%钙+1%胶原蛋白肽的高脂日粮。研究发现：与正常组相比，高脂日粮小鼠血脂和体重明显升高。1.6%钙处理可抑制体重过度升高，1%胶原蛋白肽和高钙可协同抑制调节血脂，防止体重升高。高脂主要通过影响肝脏生理节律和过氧化物酶体增生物激活受体信号通路引起脂代谢异常，高钙和骨胶原蛋白肽可显著抑制肝脏氧化应激，抑制生理节律紊乱。

胶原蛋白肽;高脂日粮;基因芯片;氧化应激

长期高脂膳食会使肝脏摄取脂肪和贮存增多，引起细胞脂肪变性和血清游离脂肪酸(FFA)升高，肝脏β氧化作用加强，导致产生过多氧自由基(ROS)，ROS攻击生物大分子，最终导致诸如动脉粥样硬化、糖尿病、炎症、癌症和衰老等疾病的发生［1］。

蛋白质和肽类抗氧化可清除体内过量的自由基。胶原多肽是各种动物胶原蛋白(皮、骨、关节等)经蛋白酶等降解后得到的相对分子量在20 kDa以下的产物，其消化吸收性不仅大大提高，同时还具有胶原蛋白的功能特性［2］。研究发现，胶原多肽具有减缓动脉硬化、抗氧化、降血压、改善骨质疏松、促进皮肤胶原代谢等功能［3］。

本研究用微波辅助水解法制备了猪骨胶原蛋白肽［4］，并发现猪骨胶原蛋白肽具有抑制高脂引起小鼠肝脏氧化应激的作用［5］，高钙日粮可与猪骨胶原蛋白肽协同发挥降血脂作用。本研究旨在探讨其发挥抗氧化作用的机理。

1 材料与方法

1.1 材料

表1 日粮配方组成(%)Table 1 Composition of diet(%)

1.2 动物实验及肝脏样品采集

选用4周龄清洁级雄性KM种小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号码：SCXK(沪)2007.0005)，体重约18±2 g。正常日粮适应1周后随机分为5组，每组8只，依次为：①对照组(0.8%Ca，w/w)(Control);②高脂组(16.10%猪油，0.8%Ca，w/w)(High.fat diet，HF);③高脂高钙组(16.10%猪油，1.6%Ca，w/w，HFHC);④高脂+1%骨胶原肽组(16.10%猪油+1%BCP);⑤高脂高钙+1%骨胶原肽组(16.10%猪油+1.6%Ca+ 1%BCP);日粮配方见表1。小鼠同室分笼饲养，温度控制在23±2℃，湿度60%，自然光照，自由采食和饮水。

每周称重一次，饲喂6 W后每组取8只小鼠禁食12 h，摘眼球取血，2919×g离心10 min后分离血清，断颈椎处死，迅速称取肝脏用于基因表达谱分析。

1.3 血脂水平测定

用试剂盒测定血清中TC、HDL-C、LDL-C和总TG含量，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 基因表达谱分析

用RNeasy Mini Kit提取细胞总RNA，取10 μg，反转录为cDNA后利用Affymetrix GeneChip 3'扩增试剂进行扩增，用生物芯片高产量RNA转录子标记试剂合成生物素标记互补RNA(cRNA)。取10 μg，按照Affymetrix基因芯片表达分析技术手册(http：//www.affymetrix.com/upport/technical/manual/ expression.man ual.affx)，在杂交炉中杂交到Affymetrix MOE430 2.0基因芯片。用基因芯片扫描仪读取荧光信号信息。基因芯片分析按照Affymetrix基因芯片表达分析技术手册进行。用 Microarray Suite 5.0进行信号强度平均化处理。基因改变用fold change(FC)表示。

鱼塘的建设和改造，不外乎以下几个方面：小池改大池或大池改小池，浅塘改深塘，漏水塘改保水塘，死水塘改活水塘，低池埂改高池埂，但同时也要根据当年所需要养殖的品种及养殖模式而确定改造建设的规划与设计。

1.5 数据分析

利用Onto-Tools(http：//vortex.cs.wayne.edu)在线分析工具中的pathway express分析显著相关基因通路，显著改变的基因通路用影响因子(IF)表示，IF值按以下公式计算：

公式中Pi为测定的特定的通路，pi为得到一个统计数值的概率，Nde为偶然发生的几率，PF为特定通路中所有基因的干扰因素，△E为用数学方法决定的标记基因的标准测量表达改变。

血脂及体重数据为平均值±标准偏差，用SPSS软件的单因素方差分析分析，用Tukey法进行多种比较。

2 实验结果

2.1 小鼠体重和血脂

试验期间小鼠体重均有不同程度的增加。试验末期高脂组小鼠增重显著高于其他组(P＜0.05) (表2)。从表3可以看出，高脂日粮处理小鼠血清TC、LDL-C和TG显著升高(P＜0.05)，而HDL-C显著降低。高钙处理仅对高脂引起TC上升有抑制作用(P＜0.05)，但无法恢复正常水平。1%BCP处理和高钙+1%BCP处理后，小鼠各项血脂与正常对照无显著差异，具有显著的降血脂作用。

表2 试验期间小鼠体重变化(g)Table 2 Weight gain of mice during experiment(g)

表3 高钙和骨胶原肽对小鼠血脂水平的影响Table 3 Effects of bone collagen peptides on lipid level in serum of mice(mmol/L)

2.2 基因表达改变的总体分析

根据Uunigen ID对MOE430 2.0基因芯片重复probe set进行剔除后，芯片共包含了45038条基因或SETs。从表4可以看出，BCP处理后诱导表达的上调基因高于高脂处理，而高脂处理诱导表达的下调基因高于BCP处理(表4)。

表4 小鼠肝脏表达显著改变的基因数目Table 4 Number of express changed genes

2.3 肝脏显著改变基因通路及相关基因

Pathway express分析的结果表明，高脂处理后显著改变的通路有5个(表5)。其中生理节律通路改变最为显著，IF高达19。在碱基切除修复通路中，NEIL3显著上调，基因改变(FC)高达15.17。该基因主要负责切除氧化反应产物氧化嘌呤如FapyG和FapyA。

BCP+高脂处理后，小鼠肝脏有12个基因通路发生显著改变，表5列出了相关性最强的7个通路。其中细胞粘着分子信号通路改变最为显著(IF值高达401)，该通路中有两个基因表达被显著抑制，包括内皮或上皮细胞紧密连接基因claudin 1(Cldn1，-2.58)和神经髓鞘蛋白零家族基因 1(Mpzl1，-2.52)。与高脂处理完全相反，BCP处理后，碱基切除修复通路中NEIL3的表达被极显著抑制(-22.44)。BCP处理后，有5个重要的细胞周期调节基因表达发生显著改变，其中G1期调控基因S期周期蛋白依赖激酶(Cip1，Cdkn1a，P21cip1)显著下调(-3.83)，G1/S期调控基因细胞周期蛋白E2(Ccne2，CCNE)表达显著上调(2.57)，G 2/M期过渡抑制因子wee1和Cdc14表达也显著上调(4.91，2)，同时，DNA损伤应激基因Gadd45γ表达也显著上调(3.16)。Ccne2、Cdkn1a和Gadd45 g三个基因也出现在P53基因通路，期表达模式可导致G1期阻滞。BCP处理诱导了Acot3、Acox1和Elovl6三个不饱和脂肪酸合成通路基因上调，表达量分别为2.17、2.64和2.37。Wnt信号通路信号上游重要基因Wnt5b表达显著上调(2.92)，可能激活Wnt通路，阻遏成脂过程。

表5 不同处理后小鼠肝脏显著受影响的基因通路Table 5 Significantly changed gene pathways in liver

过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)信号通路PPAR signaling pathway 11.001 4.06E-05 2.00E-04黑色素瘤Melanoma 7.499 0.01410325 0.004705碱基切除修复Base excision repair 7.423 0.087464771 0.005032脂肪组织细胞因子信号通路Adipocytokine signaling pathway 5.388 0.165249107 0.029200 HF+BCP处理细胞粘着分子Cell adhesion molecules(CAMs) 401.422 0.285373 1.86E-172生理节律Circadian rhythm 25.578 2.51E-08 2.07E-10碱基切除修复Base excision repair 9.031 0.216017 0.001200细胞周期Cell cycle 8.520 8.73E-04 0.001899不饱和脂肪酸合成Biosynthesis of unsaturated fatty acids 7.742 9.66E-04 0.003796 p53信号通路p53 signaling pathway 5.703 0.009671 0.022361过氧化物酶体增生物激活受体信号通路PPAR signaling pathway 5.166 0.014238 0.035192

2.4 生理节律和PPAR信号通路的改变

如图1所示，高脂处理主要引起生理节律通路中节律基因Period2(Per2)基因表达下调(-2.14)，该基因在此通路具有最重要的地位。BCP处理后节律基因Period2的表达抑制被逆转(3.13)，同时节律基因Period3表达被诱导(2.14)，而核受体亚家族基因(Nr1d1或 Rev-erba)、昼夜节律钟基因BMAL1(Arntl)和生物钟基因Clock这三个生理节律关键功能基因的表达被显著抑制，表达值分别为-2.3、-2.06和-2.09。

如图2所示，过氧化物酶体增生物激活受体信号通路中与脂肪代谢有关的细胞色素P450第7家族，alpha亚家族多肽表达显著下调(-2.51)信号接受部位的脂肪酸结合蛋白(adipocyte，3.32和epidermal(aP2)，2.29)显著上调，信号下游与脂肪细胞分化有关的脂肪细胞因子(adiponectin)显著上调(2.69)，该基因也是脂肪组织细胞因子信号通路唯一显著改变的基因，是脂肪组织细胞因子信号通路的一个重要信号分子。胆固醇7α-羟化(Cyp7a1)表达显著下调(-2.51)。adipocyte表达上调，介导大量低密度脂蛋白进入肝细胞，通过构成性表达PPARa下调CYP7A1，抑制胆固醇代谢。通过PPARg激活Ap2和ADIPO表达，促进脂肪细胞分化，引起肝脂肪浸润及脂肪肝。

图1 不同处理对生理节律通路基因表达的影响Fig.1 Express changed genes in circadian rhythm pathway

图2 不同处理对PPAR信号通路基因表达的影响Fig.2 Express changed genes in PPAR signaling pathway

3 讨论

本研究显示高钙和骨胶原蛋白肽具有显著的协同降血脂作用，这种作用主要通过调节肝脏基因表达实现。本研究中，高脂组小鼠血清低密度脂蛋白显著升高，可能与高脂饲料对肝脏生理节律信号通路的调控有关。低密度脂蛋白的主要来源之一是肝合成后直接分泌到血液，说明，高脂处理加速肝脏低密度脂蛋白的合成。研究表明，生理节律蛋白BMAL1/CLOCK二聚体可通过多种途径促进脂肪积累和脂肪细胞分化［6］。高脂饮食上调肝脏BMAL1/CLOCK抑制剂 Per的表达，可能释放BMAL1/CLOCK，导致肝脂肪累积，并向血液运输脂蛋白。本研究中，高脂处理后，肝脏过氧化物酶体增生物激活受体信号通路偏向于脂肪代谢抑制和脂肪细胞分化，也可证明以上推论。

有研究表明，生理节律与过氧化物酶体增生物激活受体信号通路有直接的联系［7］，其主要链接点为PPARa。PPARa的激活受BMAL1/CLOCK二聚体的调控。本研究中，高脂日粮诱导了PPARa介导脂肪细胞分化的激活，这一过程可能应该与生理节律通路的改变有关。

此外，有研究显示，高钙膳食可抑制脂肪吸收［8］，本研究中高钙处理抑制高脂引起体增重增加可能与此有关，但是高钙对血脂没有显著的影响，说明高钙仅仅抑制脂肪吸收，但无法抑制肝脏脂代谢紊乱。BCP和高钙+BCP处理对体重和血脂都有显著作用，说明BCP可能直接抑制肝脏氧化应激并调节肝脏脂肪代谢。

高脂处理引起NEIL3表达显著上调，而BCP处理后，NEIL3表达显著下调，说明，高脂处理诱导肝脏发生了明显氧化应激，BCP对此有显著抑制作用。有研究证明在体内羟脯氨酸游离的4-羟基能清除超氧自由基和羟基自由基，发挥抗氧化作用［9］。

1 Li JX(李建喜)，Yang ZQ(杨志强)，Wang XZ(王学智).Biological function of reactive oxygen free radicals in animals.Prog Vet Med(动物医学进展)，2006，27：33-36.

2 Xie J(谢静)，Wang CH(王传花)，Li Ke(李珂)，et al.Preparation of collagen polypeptide from bone and study evolution of its functional property.Biotechnol Bull(生物技术通报)，2008，3：13-16.

3 Lin L(林琳).Studies on preparation of collagen and bioaetivities of collagen polypeptide from the skins of aquatic animals.Qingdao：Ocean University of China(中国海洋大学)，PhD.2006.

4 Wang JY(王洁昀)，Li YX(李亚欣)，Le GW(乐国伟)，et al.Study on effect of microwave-acid treatment on enzymolysis of collagen.Technol Food Ind(食品工业科技)，2010，31：97-100.

5 Li YX(李亚欣)，Le GW(乐国伟)，Wang JY(王洁昀)，et al.Effects of collagen peptides on antioxidant capacity and serum lipid metabolism of mice fed with high fat diet.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2011，23：5 4-58，68.

6 Hemmeryckx B，Himmelreich U，Hoylaerts MF，et al.Impact of cock gne bal1 deficiency on nutritionally induced obesity in mce.Obesity，2011，19：659-661.

7 Froy O.The relationship between nutrition and circadian rhythms in mammals.Front Neuroedocrin，2007，28：61-71.

8 Papakonstantinou E，Flatt WP，Huth PJ，et al.High dietary calcium reduces body fat content，digestibility of fat，and serum vitamin D in rats.Obes Res，2003，11：387-394.

9 Zuo RY(左瑞雅)，Zhou XH(周小华)，Du SY(杜首英).Coordination mechanism and antioxidantactivity ofL-hydroxyproline zinc(Ⅱ).Chin J Biotechnol(生物工程学报)，2007，23：704-709.

Inhibition of Liver Oxidative Stress by Pig Bone Collagen Peptide-a Microarray Study

LIN Yun-jian1，2，LE Guo-wei1，2*，SHI Yong-hui1，2，SUN Jin1，2，LI Ya-xin11The Research Center of Food Nutrition and Functional Factors，School of Food Science and Technology，Jiangnan University;2The State Key Laboratory of Food Science and Technology Jiangnan University，Wuxi 214122，China

This study was aimed to explore the effect of pig bone collagen peptide on high fat induced weight gain and blood lipid increase.Forty mice were divided into 5 groups，and administrated with normal diet，high fat diet，high fat diet containing 1.6%Ca，high fat diet containing 1%pig bone collagen peptide，and high fat diet containing high Ca and collagen peptide，respectively.The results showed that high Ca intake could prevent high fat induced weight gain.Pig bone collagen peptide could significantly prevent both increase in weight and blood lipid.Microarray analysis revealed that high fat induced molecular circadian rhythm disorder in liver which might be the reason for disorder of lipid metabolism.Bone collagen peptide prevented circadian rhythm disorder and oxidative stress.

pig bone collagen peptide;high fat diet;DNA microarray;oxidative stress

1001-6880(2012)04-0454-06

2011-06-21 接受日期：2011-09-30

国家863计划(2007AA10Z325)

*通讯作者 Tel：86-510-85917789;E-mail：lgw@jiangnan.edu.cn

R151.2

A