山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达与细胞凋亡的相关性

关会敏，冉雪琴，姬志林，王嘉福，3

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳550025；2.楚雄医药高等专科学校医学检验系，云南 楚雄675000；3.贵州大学农业生物工程省重点实验室，贵州 贵阳550025）

山羊痘病毒（goat pox virus，GPV）为DNA病毒，属痘病毒科（Poxviridae）、脊索动物痘病毒亚科（Chordopoxrinae）、羊痘病毒属（Capripoxvirus），是引起山羊痘的直接病原，羔羊易感，接触感染率可达100%。山羊痘为急性、热性传染病，临床症状以皮肤、呼吸道及消化道等黏膜处出现痘疹为主［1］，发病率和死亡率均较高，严重影响了山羊养殖业的发展。痘病毒是惟一可以在感染细胞的胞质中独立复制的病毒［1］。在痘病毒侵入宿主细胞的初期，需在活细胞内完成病毒粒子的复制和组装等过程，因此病毒进化出特殊的机制在感染的早期，阻碍宿主细胞过快地发生细胞凋亡或死亡。多数痘病毒家族可产生抗细胞凋亡因子，目前已知的痘病毒抗凋亡蛋白主要有：牛痘病毒编码的CrmA蛋白，人传染性软疣病毒蛋白 MC159／160，黏液瘤病毒编码的M11L蛋白。但GPV是否产生抗凋亡蛋白还不清楚。本文着重研究GPV编码的抗凋亡蛋白基因结构及其致病机制。

1 材料与试剂

1.1 材料 山羊痘病毒株（LD株）由贵州大学动物科学学院分离［2］，Vero细胞，购自中国典型培养物保藏中心，大肠杆菌DH5α和载体pBluscript.SK由本实验室保藏。

1.2 试剂 RM1640／M199干粉为Gibco公司产品，胎牛血清由HyClone公司生产，PCR相关试剂，购自天根生化科技（北京）有限公司，RNA fast200总RNA极速抽提试剂盒，购自上海飞捷生物公司，引物和碱基序列的测定由上海捷瑞生物科技有限公司完成。

2 方法

2.1 细胞及病毒的培养 Vero细胞接种于含10%胎牛血清的RM1640培养基中37℃培养成单层。接毒GPV（MOI＝50），吸附1～1.5h，加入含2%胎牛血清的RM1640培养基，37℃培养，当70%～80%细胞脱落时，胰蛋白酶消化收集细胞，反复冻融，4 000 r／min离心20min，取上清－20℃保存备用。

2.2 细胞病变及凋亡检测 取GPV感染0、12、18、24、36、48h的 Vero细胞，观察细胞的形态变化；0.4%台盼蓝染色，计数死亡细胞数并计算细胞的死亡率（死细胞／总细胞数×100%）；吖啶橙（AO）／溴乙锭（EB）混合染色［3］，计数细胞凋亡数并计算细胞的凋亡率（凋亡细胞／总细胞数×100%）。

2.3 病毒基因组的提取［4］病毒液经SDS和蛋白酶K，56℃水浴消化1h，加入等体积的酚－氯仿－异戊醇（25∶24∶1）溶液抽提，离心，取上清，3mol／L醋酸钠（pH 值5.2）和无水乙醇，－20℃沉淀30 min，于4℃ 12 000r／min离心15min，取沉淀用70%乙醇洗涤2次，离心，自然干燥，溶于TE溶液。2.4 基因的扩增及克隆

2.4.1 引物设计 据已知序列设计P1／P2、P3／P4两对特异性引物，其中P1／P2用于山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的克隆，P3／P4用于基因表达的检测。引物碱基序列为：P1：5′－GTGCTCTTCCAACATGGATAACTATAACTACAACA－TAG－3′，P2：5′－CCTCTGCAGTTACTTCCATCGTA TCCTACC－3′，下划线部分为SapⅠ和PstⅠ酶切位点；P3：5′－GAATGTGTACTTGCGAGACT－3′，P4：5′－CTTCC ATCGTATCCTACCAAT－3′，另设计一对引物P5／P6，分析β－actin基因的表达量作为内参照，P5：5′－GGCTACA GCTTCACCACCAC－3′，P6：5′－TACTCCTGCTT GCTGATCCAC－3′。

2.4.2 基因的扩增及克隆 以1μg山羊痘病毒基因组DNA为模板，P1／P2为引物，扩增山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因，扩增条件：94℃变性8min；94℃40s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃ 5min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，染色，观察，回收目的片段，SapⅠ和PstⅠ双酶切，与pBluscript.SK质粒连接，转化感受态细胞DH5α，涂布LB平板（含氨苄西林），37℃培养过夜，挑取阳性克隆。经质粒大小、菌落PCR和质粒PCR鉴定为阳性的重组子测定碱基序列。

2.5 GPV抗凋亡蛋白基因的RT－PCR分析 提取细胞和病毒总RNA，经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，合格样本经反转录，以引物P3／P4扩增山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因片段，同期以引物P5／P6检测β－actin基因的表达量为内参。1%琼脂糖凝胶电泳检测，Gene tools软件（Gene co.）分析基因的相对表达量。

3 结果

3.1 细胞凋亡率及死亡率 与对照组（图1A）相比，GPV感染Vero细胞24h之前，细胞的形态没有明显的变化，24h之后出现明显的形态学改变：细胞变圆，聚集成堆、拉丝、脱落（图1B），48h时，细胞大量脱落、裂解。台盼蓝染色结果显示，随着病毒感染时间的延长，Vero细胞的死亡率逐渐增加：36h约为80%，48h接近100%（图2）。经AO／EB染色，随机计数200个细胞，计算细胞的凋亡率。与对照组相比，至24h时没有明显的细胞凋亡，36h时检测到凋亡细胞，以早期凋亡为主，48h细胞凋亡率明显增加至13%，且以晚期凋亡为主，同时坏死细胞也随之快速递增，达到87%（图3）。

3.2 山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的克隆 以P1／P2为引物PCR扩增，获得1条约530bp的条带（图4，5），经克隆测序（图6），证实重组子中含有插入片段531bp，经NCBI核酸库在线比对，确认本文克隆到的531bp DNA片段确为山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因（goat pox virus antiapoptosis protein），命名为GGPVAP基因，作为一个独立的基因登录到Gen－Bank上（EF536858）。

图5 重组质粒的酶切鉴定

在GGPVAP序列中，（A＋T）对的含量为77.97%，基因编码完整的抗凋亡蛋白，由176个氨基酸组成，分子量20.76kD，等电点（PI）7.58。经NCBI蛋白库在线分析，与GTPV＿gp014相似性100%，与LSDV017相似性为96%，与SPPV－14的相似性为95%，均属于抗凋亡膜蛋白PHA02855超家族，具有固定的结构域，且与M11L蛋白家族固定结构域类似。

以DSA软件（www.expasy.org）进行在线分析，GGPVAP蛋白的C端有一显著跨膜域，含有22个氨基酸，位于146～167位氨基酸区段，而M11L蛋白的C端也有类似的跨膜域，且均是由外向内。在跨膜域内，154、155、158三个位点的氨基酸高度保守，分别是缬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸，均为疏水性氨基酸，推测其在跨膜结构中起着重要的作用。

3.3 GGPVAP基因的表达变化 以提取细胞和病毒总RNA为模板，以β－actin为内参照，经RT－PCR对GGPVAP基因的表达量进行分析，结果显示，随着感染时间的延长，GGPVAP基因的表达量逐渐上升，至24h时达到最大（P＜0.05），之后转而下降，36h时降到12h时的水平（P＞0.05）（图7）。

4 讨论

以本地分离的山羊痘病毒（GPV）感染敏感的Vero细胞，至24h时之前未检测到Vero细胞的凋亡，GPV作用48h时才检测到Vero细胞凋亡，凋亡率13%，同时以台盼蓝染色检测到Vero细胞的大量坏死。大肠杆菌志贺样毒素Stx2（2μg／mL）作用Vero细胞24h细胞的凋亡率就达到了90%［5］。相比之下，山羊痘病毒感染Vero细胞的凋亡率明显偏低，提示本地分离的山羊痘病毒作用于Vero细胞后凋亡发生的时间被推迟。进一步研究GPV感染Vero细胞过程中GGPVAP基因的表达量变化，结果显示，GGPVAP基因的表达量24h时出现峰值，之后转而下降，与Vero细胞凋亡率的变化呈反变关系。

图7 GGPVAP基因的表达变化

牛痘病毒编码的CrmA蛋白是抗凋亡蛋白因子之一，可直接作用于IL－1β转化酶，抑制caspase的活化，阻断细胞凋亡的信号传递，抑制细胞凋亡［6］；人传染性软疣病毒的 MC159／160蛋白，阻止caspase 8的活化，阻断Fas和TNFR1介导的细胞凋亡［7］；黏液瘤病毒编码的 M11L蛋白定位于线粒体膜上，通过与Bak和Bax作用阻止线粒体凋亡途径的发生［8］。从贵州山羊痘病毒基因组中分离出山羊痘病毒的抗凋亡蛋白，与同属病毒凋亡蛋白的相似性95%～100%，M11L家族蛋白相似性为31%～36%，由此明确克隆到的基因GGPVAP确为山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因。同时，GGPVAP蛋白的C－端含有与痘病毒家族抗凋亡蛋白类似的跨膜域，提示该跨膜域可能作为细胞内膜性受体或离子通道，抑制细胞凋亡信号的传导，起到延缓或抑制Vero细胞凋亡的作用。细胞凋亡是宿主细胞对病毒感染的主动防御机制之一，是免疫监控的一部分。被感染的细胞以凋亡方式阻止病毒繁殖，保护其他的组织细胞免遭病毒的侵害。GPV一旦进入宿主山羊的体内，就能迅速增殖，动物之间的传染率高、发病率也较高。由此推测GPV侵入后，表达的山羊痘病毒抗凋亡蛋白可以有效阻止宿主细胞的凋亡进程，至24h（可改为“至24h”），病毒已基本完成了病毒粒子的复制及其装配过程［1］，结合本文的检测结果，24h后山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量下降，宿主细胞的凋亡或坏死得以发生，此时细胞发生的坏死导致的破裂则有助于病毒的释放，进一步侵染其他的细胞。

［1］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学出版社，1997：939－963.

［2］徐春志，周碧君，岳筠，等.感染细胞与痘疹样本中山羊痘病毒PCR检测方法的建立［J］.中国兽医学报，2008，28（12）：1387－1390.

［3］Ching J C Y，Jones N L，Ceponis P J M，etal.Escherichia coliShiga－Like Toxins Induce Apoptosis and Cleavage of Poly（ADP－Ribose）Polymerase via In Vitro Activation of Caspases［J］.Infection and Immunity，2002，46－70.

［4］罗阿东，岳筠，程振涛，等.山羊痘病毒基因组DNA的提取及酶切分析［J］.动物医学进展，2008，29（8）：1－4.

［5］李灿，冉雪琴，王嘉福.猪水肿病毒素Stx2e的致Vero细胞凋亡作用［J］.微生物学报，2009，49（5）：658－663.

［6］DobóJ，Swanson R，Salvesen G S，etal.Cytokine Response Modifier A Inhibition of Initiator Caspases Results in Covalent Complex Formation and Dissociation oftheCaspaseTetramer［J］.The Journal of Biological Chemistry，2006，281（50）：38781－38790.

［7］Nichols D B，Shisler J L.Poxvirus MC160Protein Utilizes Multiple Mechanisms To Inhibit NF－B Activation Mediated via Components of the Tumor Necrosis Factor Receptor 1Signal Transduction Pathway［J］.Journal of Virology，2009，83（7）：3162－3174.

［8］Su J，Wang G，Barrett J W，etal.Myxoma Virus M11L Blocks Apoptosis through Inhibition of Conformational Activation of Bax at the Mitochondria ［J］.Journal of Virology，2006，80（3）：1140－1151.