几种抗菌药物对嗜水气单胞菌突变选择窗（MSW）范围的研究

俞观泉，卢彤岩，杨雨辉

（1.海南大学农学院，海南 海口570228；2.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 ，黑龙江 哈尔滨150070）

传统药效理论认为，当抗菌药物浓度低于MIC时，容易被筛选出耐药菌株，从而导致细菌耐药。因此在以往的给药方案设计中，给药间隔的设计主要是根据MIC来确定［1］。但最近提出的突变选择窗（Mutation Selection Windows，MSW）概念改变了传统上的这一理论，突变选择窗理论认为病原菌与药物接触过程中，有一个高于MIC的浓度范围可以杀死或抑制敏感细菌，但是在感染细菌群体中少数自发突变耐药的细菌则可能存活下来，并得以繁殖。一般将这个浓度范围称为 MSW［1－4］。突变选择窗的下限是MIC和MIC99之间的范围，突变选择窗的上限被定义为当体内试验细菌为1010个时，无耐药突变株生长的药物浓度，即防突变浓度（MPC）。当药物浓度低于MIC时，由于药物浓度较低而未作用于耐药突变菌群，因此不会产生耐药，但也不能达到预期的治疗目的；当药物浓度高于MPC时，由于病菌必须同时产生两种或两种以上的耐药突变才能生长，因此也不可能产生耐药；只有当药物浓度高于MIC并低于MPC时，即药物浓度处于MSW范围之内的时候，才容易导致耐药突变菌的选择性扩增并产生耐药性［2－4］。

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属于弧菌科（Vibrionaceae）气单胞菌属的细菌（Aeromonas），是一种革兰阴性兼性厌氧的短杆菌［5］。广泛存在于淡水、污水、淤泥、土壤中，是自然界中的一种常见菌。大部分菌株一般无致病性，但致病菌株可引起鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类感染［6］。人也可以感染嗜水气单胞菌而引起腹泻，是一种典型的人－兽－鱼共患病原菌。目前关于抗菌药物对嗜水气单胞菌MIC和 MBC的测定已有文献报道［7］，但关于MSW的研究还未见报道，针对于此，本研究进行了几种常用抗菌药物对嗜水气单胞菌MSW的研究，旨在为制定抗菌药物的合理给药方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 待测菌株 本研究使用的嗜水气单胞菌均分离自东北三省患病的水生动物。

1.2 抗菌药物 盐酸恩诺沙星由浙江国邦药业有限公司生产；氟苯尼考由湖北中牧安达药业有限公司生产；卡那霉素（Biosharp／Amresco 0408）。

1.3 培养基 营养肉汤培养基和营养琼脂培养基，均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.4 方法［8－10］

1.4.1 细菌数量的测定 挑取单个菌落接种于6 mL肉汤中30℃恒温预培养12h，取0.1mL菌液接种于100mL的肉汤中30℃、100r／min震荡培养12 h，平板计数法测细菌数量，30℃培养12h后计数。

1.4.2 MIC和MIC99的测定 试管双倍稀释法测MIC，把浓度为1.28mg／mL的药液以1∶9的比例加入到肉汤中，用双倍稀释法稀释至13个浓度梯度。最终不同含药肉汤的体积均为0.5mL。把稀释后的菌液加入到含药肉汤中，使每个浓度的肉汤中含菌量为3×105CFU。30℃培养16～18h后观察结果。以最低不长菌的浓度为MIC。相同过程重复5次。

在MIC的基础上线性递减20%抗菌药浓度制成平板，把不同稀释度的菌液接种于平板上，使每个药物的浓度药物平板上的含菌量为3×102、3×103、3×104、3×105CFU。30℃培养24h后，选合适的平板计数。限制99%的细菌生长的平板药物浓度为MIC99。

1.4.3 MPC的测定 分别以2MIC、4MIC、8MIC、16MIC浓度的抗菌药物制作药物平板，浓缩菌液并调整浓度。每个药物平板接种0.1mL菌液，每个药物浓度4个平板，使每个浓度最终接种菌的量达到1.2×1010CFU。30℃下培养72h，观察结果，最低不长菌的浓度为MPCpr。在MPCpr的基础上线性递减20%制作药物平板，以相同的方法接种细菌。最低不长菌的浓度就是MPC。

2 结果

3种抗菌药对5株临床分离的嗜水气单胞菌的MIC99和MPC结果见表1。

表1 3种抗菌药对5个嗜水气单胞菌的MIC99和MPC

由结果可见，卡那霉素和盐酸恩诺沙星对5株嗜水气单胞菌的MIC99相差不大，但MPC之间有较大的差异：卡那霉素对4号菌株的MPC明显大于其他几个菌株，恩诺沙星对2号菌株的MPC明显小于其他菌株；氟苯尼考对2号菌株MIC99明显大于其他4株嗜水气单胞菌，而MPC值均大于128μg／mL。

3 讨论

由结果可见，恩诺沙星对5株嗜水气单胞菌MIC99相差不大，恩诺沙星对2号菌株的MPC明显小于其他菌株，故恩诺沙星对2号菌株的MSW也明显小于其他菌株。卡那霉素对5株嗜水气单胞菌MIC值变化不明显，但各菌株之间MPC有明显差异。其中2号菌株的MPC最低，4号菌株的MPC最高。5株嗜水气单胞菌中除2号菌株外，氟苯尼考对其他菌株的MIC相差不明显，而2号菌株的MIC明显高于其他菌株。由于氟苯尼考对5株嗜水气单胞菌的MPC均高于128μg／mL而未测出，故表中标记菌株对氟苯尼考的MPC为未知。这种MIC相差不明显，而MPC相差较大的原因，目前还不得而知，可能与菌株产生耐药突变的基因不同有关，具体原因还需要进一步研究。

根据以前一些关于氟喹诺酮类药物对病原菌MIC和MPC的测定结果来看，MPC／MIC的范围在4～12之间［11－12］，在本研究中，测定的恩诺沙星对嗜水气单胞菌的MPC／MIC在5～18之间，以前文献报道的MPC／MIC的范围更宽，这可能说明临床分离的病原菌对药物的敏感性差异非常大，同时说明了相同的给药方案对不同病例的治疗结果可能会有很大的差异。

传统抗菌药物的药效学理论认为［1－2］，给药方案的制定应该以MIC为依据，药物浓度高于MIC是保证治疗效果的最基本的要求。但MSW理论认为药物浓度达到MIC值有一定的治疗效果，但易产生耐药菌。因而治疗量应该用高于MPC的浓度。MSW理论的出现对抗菌药物的使用和研究提出了更高的要求，该理论不仅关注治疗效果，更将耐药性的产生因素考虑在内，因此在该理论指导下制定的给药方案更能合理应用抗菌药物，防止耐药性的产生和扩散。由本研究的结果与恩诺沙星和氟苯尼考现有的在水生动物体内的药动学数据［13－15］共同分析认为，恩诺沙星在鲤鱼体内药物浓度达到峰浓度后20h以上高于MIC，但是恩诺沙星在鲤鱼体内达到峰浓度后只13h和15h内分别高于4号和2号菌株的MPC，对于其他菌株维持在MPC之上的时间则较短。氟苯尼考在罗非鱼体内的药物浓度在达到峰浓度后15h时仍高于MIC，但是其峰浓度却远低于MPC。因此认为，目前恩诺沙星和氟苯尼考的给药方案虽可发挥一定的治疗效果，但容易导致细菌耐药性的产生。卡那霉素由于缺乏相关的药动数据，因此未对卡那霉素的药效及耐药进行分析。

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