1株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定

齐海涛，闫军霞，粟 硕，黄 震，曹 楠，谭力凯，孔维立，张桂红

（华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642）

猪流感（SI）是由A型流感病毒引起的猪的一种急性、传染性呼吸道疾病，以发热、流鼻液、咳嗽、食欲减退等症状为特征，病猪可在短期内康复，但会降低饲料报酬，延迟上市时间。目前猪群中的SIV主要有H1N1、H1N2和H3N2 3种亚型。我国猪群中普遍存在H3和H1亚型感染。更为重要的是，猪可以被禽流感病毒和人流感病毒同时感染，猪被认为是流感病毒的“混合器”，在“禽－猪－人”的传播链中具有独特的地位［1－2］，SI具有重要的公共卫生意义。

2009年在墨西哥、美国等国家相继暴发甲型H1N1流感，疫情很快在全球范围内传播，并导致人死亡［3］。2011年12月美国 H3N2流感感染人事件，并在人与人之间传播，引起人们的广泛关注。本论文对分离到的1株SIV进行全基因序列测定及序列分析，从分子水平阐明广东地区的猪流感流行状况和遗传演化情况，为进一步阐述猪在流感病毒分子流行病学以及“禽－猪－人”跨种间传播奠定基础，为流感的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标准阳性血清 H1、H3、H5、H9亚型标准阳性血清由华南农业大学禽病研究室保存。

1.1.2 SPF鸡胚 购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，置生化培养箱中37℃孵育至9～11日龄。

1.1.3 主要仪器 高速低温冷冻离心机、T gradient PCR仪、L8－M冷冻离心机等。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集、病毒分离及纯化 2010～2011年从广东猪场采集60份流感症状猪鼻拭子和病猪肺组织。常规方法尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，37℃孵育，72h收集尿囊液，测定血凝效价（HA），将阳性的病毒分离物用SPF鸡胚进行3轮有限稀释克隆纯化。

1.2.2 病毒亚型的鉴定 将纯化的病毒株通过猪流感病毒 H1、H3、N1、N2亚型分型RT－PCR方法［4］和序列测定，进行HA和NA亚型鉴定。

1.2.3 病毒全基因序列的测定及遗传演化分析根据GenBank中登录的猪流感病毒序列，设计流感病毒通用引物8对。对H3N2亚型流感分离株的全基因组进行克隆、序列测定，用Lasergene7.0软件包进行序列拼接和分析，用MEGA4.0分析软件制作基因进化树。

2 结果与分析

2.1 亚型鉴定结果 从60份样品中分离到SIV 1株，通过猪流感病毒H1、H3、N1、N2亚型分型RTPCR方法对该株SIV进行了HA和NA亚型的鉴定，该毒株为H3N2亚型猪流感病毒。测序结果与SIV分型RT－PCR方法的鉴定结果一致。命名为A／swine／Guangdong／L22／10（H3N2）。

2.2 RT－PCR扩增结果 以流感病毒总RNA为模板，分别用设计好的8对通用引物对PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS 8个基因片段进行 RTPCR扩增，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，扩增的各片段大小与预期目的片段相符。

2.3 核苷酸同源性 将H3N2亚型流感病毒的全基因序列提交至NCBI BLAST SERVER进行联机检索，用Lasergene7.0中的 MegAlign程序中的ClustalW对其核苷酸序列进行相似性比较分析。结果表明，本研究毒株的8个基因片段与广东地区2005年和2006年猪群中流行的猪流感病毒（4个毒株均为人源SIV）基因的相似性，在99.8%～100%之间（表1），与1999年前后人流感病毒代表株A／Moscow／10／99（H3N2）的 NA、M、NS、PB2、PB1基因片段相似性均为99.6%，HA、NP、PA的相似性均为99.5%。从BLAST结果可以看出，本试验毒株近年来在猪群中比较稳定，未和不同亚型、不同宿主和不同地域来源的流感病毒发生基因重组。

表1 流感毒株8个基因片段核苷酸序列Blast检索结果

2.4 序列分子特征分析 H3N2亚型猪流感病毒的HA基因编码区长1 701bp，编码566个氨基酸。本试验毒株的裂解位点为PEKQTR／GIF，与高致病性禽流感病毒裂解位点相比较，具有典型的低致病性流感病毒特征。大多数H3N2流感病毒HA蛋白含有6个比较保守的潜在糖基化位点，分别位于 HA1的 N8，22，38，165，285位以及 HA2上的483位。HA蛋白潜在糖基化位点的增加，可能会改变病毒的抗原性或是增强病毒的流行性，使其能够逃避宿主的免疫压力。例如，在人流感流行时，往往是HA中潜在糖基化位点较多的毒株能够流行到最后［5］。不仅如此，潜在的糖基化位点的增加还能影响病毒的受体结合活性和抗原性，糖基化位点的数量和位置可能会影响蛋白质的折叠、组装、聚集和转移［6］。本试验猪流感病毒在63、122、126、133位和246位增加了5个潜在糖基化位点，在这些位点中，122，133和246位潜在糖基化位点为近代人源谱系毒株所特有。流感病毒的受体结合特异性与HA蛋白的受体结合位点密切相关。对人H3N2流感病毒而言，HA L226位（Leu）和S228位（Ser）氨基酸的改变影响病毒与SA－α－2，6－Gal的受体结合特性。通过受体结合位点的分析发现，本试验毒株与宿主特异性有关的226～228位对应的氨基酸为ISS具备人流感的分子特征，该病毒偏爱结合SA－α－2，6－Gal受体［7］，具备感染人的能力。

经氨基酸序列分析发现流感病毒的NA蛋白有6个保守的潜在糖基化位点，分别位于61、86、146、200、234位和402位（表2），本试验毒株与猪流感和人流感代表株相比在93、329位多了2个潜在的糖基化位点；NA蛋白的潜在糖基化位点的增加或减少可能会降低流感病毒与宿主受体的亲和活力，也可能减少流感病毒颗粒的释放［8］。本试验SIV的N－端的Ser－31未发生突变［9］，说明没有对金刚烷胺产生耐药性。整个NS1编码区中未发现缺失，92位也没有出现抗干扰素的Glu［10］突变。PB2基因的627位氨基酸与宿主特异性和病毒复制能力密切相关，本试验毒株的627位氨基酸位点为人源K，从氨基酸水平揭示该毒株具有感染哺乳动物的能力。

表2 NA基因潜在糖基化位点分析

2.5 病毒HA和NA基因核苷酸系统进化分析应用MEGA4.0分析软件，将该分离株的HA基因与GenBank上21株流感病毒的HA基因阅读框架内的核苷酸序列绘制系统进化树，可以将猪和人的H3N2流感病毒大概分为最早期人流感谱系、早期人流感谱系、近代人流感谱系和经典猪流感谱系4个 谱 系。 结 果 显 示，A／swine／Guangdong／L22（H3N2）的8个基因片段处在近代人流感谱系内，没有和猪流感、禽流感病毒发生基因重组，与1999年前后人流感病毒株 A／Moscow／10／99（H3N2）亲缘关系较近（图1），与猪流感谱系亲缘关系相对较远。NA基因的进化分析也显示相似的特征（图2）。

3 结论与讨论

本试验毒株具有典型的低致病性流感病毒特征，从分子特征上看这个毒株可能来自人流感，具备感染人的能力。该病毒的NA蛋白颈部氨基酸无任何缺失，NS1蛋白的92位也没有出现抗干扰素的Glu突变；M2蛋白对金刚烷胺也没有产生耐药性。结合目前中国猪场的用药来看，猪群中没有大规模的应用干扰素、金刚烷胺等抗病毒药物，因此该株流感病毒都没有出现抗药性突变。本毒株的8个片段全部处于近代人流感谱系内，相似性分析结果也显示，该毒株的8个基因片段与近代人流感病毒的相似性高，1998～2009年间从中国猪群中分离到的H3N2SIV大部分处于近代人流感谱系内，与人流感病毒亲缘关系较近，这一结果暗示着在不同时间内均发生过人流感病毒传染给猪的事件，这可能是与猪有密切接触人员将人流感病毒传染给猪，导致流感病毒在猪群中流行，但是这些病毒什么时候还会再感染人目前还不太清楚，需要不定期的监测猪群中猪流感的流行状况，为人流感的暴发预警。

猪在流感跨种间传播过程中起着“混合器”和“中间宿主”的作用。最近美国CDC报道，由HA、NA等7个基因来源于人流感病毒，而M基因则来源于经典H1N1猪流感病毒的重组H3N2流感病毒感染两名美国儿童，给人类健康造成了潜在威胁，新奇重组流感病毒在猪群中不断产生，也可能造成像PDM／09一样产生新的一轮流感的暴发流行。本试验分析发现，目前猪群中流行的H3N2流感毒株大部分为人流感，一旦在猪这个混合器中与猪流感病毒的基因片段发生重组，产生新奇流感病毒，病毒在猪体内适应之后再传给人，那样就可能给人类健康带来严重的威胁。因此，在广东地区开展猪流感的分子生物学和病毒遗传进化规律的研究，对于及时掌握我国SIV流行株的变异情况，为猪群中流感病毒的监测、分子生物学特征及其科学防控提供理论依据。

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