CYP17基因单核苷酸多态与子宫内膜异位症和子宫腺肌病易感性的关系

张 峰，薛素萍，曲银娥＊

（1.河北大学卫生职业技术学院，河北 保定071000；2.河北联合大学基础医学院）

子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是指内膜组织出现在子宫体以外的部位，一般仅见于生育年龄妇女；子宫腺肌病（Adenomyosis，Ad）是指子宫内膜腺体和基质侵入子宫肌层，多发生于40岁以上的经产妇。EMs和Ad均为雌激素依赖性疾病，临床上常可并存，但发病机制及组织学发生不尽相同［1］。细胞色素P45017c羟化酶／17、20裂解酶由CYP17基因编码，是雌激素代谢的关键酶，在一定程度上决定体内雌激素水平。CYP17基因5＇非编码区翻译起始点－34bp处T－C单核苷酸多态与前列腺癌［2］和子宫内膜癌［3］等疾病遗传易感性有关，与内异症的关系目前尚存在争议［4，5］。本文应用PCR－RFLP技术，检测了内异症、腺肌病和健康女性CYP17基因－34bp处T－C单核苷酸多态，旨在探讨CYP17基因单核苷酸多态与内异症和腺肌病风险的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2007年3月－2009年2月保定市第三医院剖腹或腹腔镜手术的61例子宫内膜异位症患者（内异症组）和59例子宫腺肌病患者（腺肌病组），所有病例均经病理确诊；选择同期在此院体检的健康女性65例为对照组。3组年龄分别为29.47±2.3岁、32.15±1.9岁、30.9±3.2岁，组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。所有研究对象无血缘关系，月经周期规律，无其他内外科及内分泌疾病，排除家族性遗传疾病如糖尿病、高血压等疾病，术前三个月无服用激素类药物及免疫抑制类药物。

1.2 主要试剂和仪器

限制性内切酶MspA1I、dNTP和TaqDNA聚合酶为美国Promega公司产品，PCR扩增试剂盒购自加拿大Sangon公司，CYP17引物由北京赛百盛公司合成，凝胶电泳成像系统为FUJI FILM公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA提取 清晨空腹采集5ml静脉血，柠檬酸钠抗凝，蛋白酶K消化－苯酚法提取外周血基因组DNA，－70℃保存。

1.3.2 引物设计与合成 根据Genebank查询的基因序列，用Primer 5软件，设计1对特异性引物，由北京赛百盛公司合成。

上游：5′－CATTCGCACTCTGGAGTC－3′

下游：5′－AGGCTCTTGGGGTACTTG－3′

片段大小为419bp

1.3.3 PCR扩增体系及程序 25μl反应体系：10×PCR buffer 2.5μl、去离子水17.3μl、上下游引物各5μl（20μM）、dNTPs 2μl、Taq聚合酶0.2μl（5U／μl）、模板 DNA 2μl（20ng／μl）。反应程序：94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1 min，72℃延伸1min，共35个循环，末次循环后，72℃延伸5min，4℃保存。

1.3.4 酶切鉴定基因型 PCR产物经限制性内切酶MspA1I于37℃酶切过夜，20μl酶切体系：10×NE buffer 2μl、双蒸水12.3μl、PCR产物5μl、100×BSA 0.2μl、MspA1I0.5μl（10U／μl）。取10μl酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，确定基因型。随机选择CYP17 3种基因型PCR产物，送北京赛百盛公司测序验证基因型。等位基因频率＝（2×纯合子数＋杂合子数）／（2×受检人群）。

1.4 统计学分析

应用SPSS16.0软件进行统计学处理，基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算，χ2检验比较各组间基因型及等位基因频率差异，非条件Logistic回归计算比值比（OR）及95%可信区间（CI），确定基因型与内异症和腺肌病发生的关联强度。

2 结果

2.1 CYP17基因MspA1I酶切后基因型检测结果

PCR产物及酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，可见CYP17基因扩增片段为419bp；CYP17基因－34bp处的T－C碱基置换后，产生一个能被内切酶MspA1I识别的位点，因此PCR产物经MspA1I酶切后，可产生3种基因型：野生纯和型（A1A1）无 MspA1I酶切位点，仅有419bp 1个片段；突变纯和型（A2A2）含有1个酶切位点，被切割为295bp、124bp 2个片段；杂合型（A1A2）被切割为419bp、295bp和124bp 3个片段（图1）。随机选择CYP17 3种基因型PCR产物进行测序验证，显示碱基改变与酶切结果相吻合。

图1 CYP17基因型图谱

2.2 CYP17基因单核苷酸多态与内异症和腺肌病的关系

内异症组和腺肌病组A1A1基因型频率及A1等位基因频率均高于对照组，差异均有统计学意义；内异症组与腺肌病组之间差异均无统计学意义（表1、表2）。3组基因频率分布均符合 Hardy－Weinberg遗传平衡定律。

表1 3组CYP17基因型频率比较（例数）

表2 3组CYP17等位基因频率比较 （%）

2.3 CYP17各基因型的相对危险度分析

非条件Logistic回归结果表明：A1A1和A1A2基因型的个体发生内异症的相对危险度（OR）分别是A2A2型个体的4.615倍和3.467倍，发生腺肌病的相对危险度分别是A2A2型个体的3.692倍和3.867倍，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示A1A1、A1A2基因型可能增加内异症和腺肌病发生的危险性，CYP17基因T－C单核苷酸多态与内异症和腺肌病风险有关（表3）。

表3 CYP17 3种基因型相对危险度分析

3 讨论

细胞色素P450c17α羟化酶／17、20裂解酶是雌激素合成代谢的关键酶之一，也是雌激素合成过程中的限速酶，介导类固醇17α羟化酶和17、20裂解酶活性，参与胆固醇前体向雄激素、雌激素或孕激素以及盐皮质激素或糖皮质激素的转化，由CYP17基因编码。CYP17基因5′非编码区翻译起始点－34bp处有1个T－C单核苷酸突变，由于T－C的替换产生了限制性内切酶MspA1I的酶切位点，产生Al和A2两种等位基因，当等位基因A2存在时，理论上可以增加基因的转录效率，提高酶的活性，促进雄激素合成增多［6］。

研究中发现，A1A1、A1A2和A2A2基因型频率及A1等位基因频率在腺肌病组和内异症组之间差异无统计学意义，提示腺肌病和内异症在CYP17基因T－C单核苷酸多态方面具有相似的发病机制；危险度分析显示A1A1和A1A2基因型个体发生内异症的相对危险度分别是A2A2型个体的4.615倍和3.467倍，发生腺肌病的相对危险度分别是A2A2型个体的3.692倍和3.867倍，表明A1等位基因为内异症的高危险因素，A1A1和A1A2基因型为内异症和腺肌病的易感基因型。Hsieh等［4］发现CYP17基因的A1纯合子等位基因增加内异症的危险性，李维麟等［7］发现携带A1等位基因的妇女患内异症的风险可能更高，与我们的结论一致。Aban等［8－10］和 Garmer等［11］分别在对子宫内膜癌和卵巢癌的研究中得到相似结论，而王晓莉［12］等发现CYP17基因启动子区T－C多态与成都地区子宫肌瘤发病风险无相关性。CYP17基因多态性增加内异症易感性的机制目前仍不清楚，推测可能由于CYP17基因5′端启动子－34bp处的T－C点突变上调了CYP17基因表达，进而造成雄激素合成增多；同时，可能A1等位基因结合、代谢循环中的雌激素能力较低［13］，因此，A1A1和 A1A2基因型个体雌激素水平较高，发生内异症和腺肌病的危险增加，与临床上绝经后内异症和腺肌病病灶逐渐萎缩一致。

由于CYP17基因多态性具有明显的地域和种族差异，且所选择的内异症和腺肌症患者的临床分期、月经周期等不同，加之基因间的相互作用，不同的研究可能得出不同的结论，尚需在不同人群中扩大样本量进一步研究。

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