琼脂扩散法检测卵黄抗体效价影响因素的分析



琼脂扩散法检测卵黄抗体效价影响因素的分析

王尚明①吴好停②宗玉东③（①山东迅达康兽药有限公司 济南 250316 ②中国兽医药品监察所 北京 ③山东省广饶县畜牧局）

抗体琼脂扩散试验是当前卵黄抗体效价测定的主要方法之一，该方法简洁、快速非常适合于临床中应用，但是该方法容易受到多种因素的影响而导致试验结果判断的不准确。本文就琼脂扩散试验中抗原抗体本身性质、反应特点、最适比例、可逆性、总量以及琼脂、水等所有能影响试验结果的因素进行了逐一分析。

卵黄琼脂扩散试验是通过抗原、卵黄抗体在琼脂凝胶中由近及远不断自由扩散形成浓度梯度，在适当比例处相遇形成沉淀线，并由此来判断抗体效价的一种技术。琼脂扩散试验主要是用于可溶性胶原性抗原及其所对应抗体水平的检测，兽医临床中主要用于法氏囊病、新城疫等抗体效价的检测。由于卵黄内抗体效价与鸡体血清内的效价几乎相同，所以通过琼脂扩散试验测定卵黄抗体的效价，可以在不刺激鸡体的情况下就可知道产蛋鸡的抗体水平和免疫效果。卵黄琼脂扩散试验操作简单、所用的仪器少、结果易判断，因此被越来越多的养殖户、兽医工作者所采用，成为制定产蛋鸡免疫程序的主要依据。但是琼脂扩散试验的结果容易受到抗原抗体因素、琼脂、反应条件以及其它因素的影响而导致抗体效价测定不准确。为了能使临床中广大实验操作人员在琼脂扩散试验中获得一个更加准确的结果及正确认识，现将以上各种影响因素分析如下。

1 抗原抗体因素

琼脂扩散试验受抗原抗体本身性质、抗原抗体反应特点及其它因素的直接影响。

1.1 抗原抗体的性质

1.1.1 抗体性质 抗体的特异性与亲和力是影响琼脂扩散试验的主要因素。抗体的特异性是由抗体可变区的原子空间排列及其电子结构和极化特性决定的(王明俊等，1997)，亲和力是复杂抗原与相应抗体之间的总的结合能力(余传霖等，1998)。抗体的亲和力很低时不易用琼脂扩散试验测定。一般情况下，在免疫初期，卵黄抗体的特异性较高但亲和力不高，后期，卵黄抗体的亲和力高但相应的特异性变低。

1.1.2 抗原性质 抗原的种类、抗原决定簇的数目和理化性质等因素都能影响琼脂扩散试验的结果。琼脂扩散试验是利用可溶性的抗原与抗体在琼脂凝胶网格中的水中自有扩散，相互结合形成的沉淀线来判断结果的。这样就要求抗原与抗体必须都是可溶性的，因为一些颗粒性的抗原如细菌、红细胞等是不溶的，这样的抗原相对应的卵黄抗体效价就不能用琼脂扩散试验来测定。在琼脂扩散试验中要求抗原是多价的(抗原决定簇≥2)，单价抗原不能形成抗原抗体复合物，因此不能产生可见反应。抗原的分子量、pH值等理化因素也直接影响到试验的结果。

1.2 抗原抗体的反应特征

抗原抗体反应特征影响琼脂扩散试验结果的因素有：抗原抗体最适比、抗原抗体反应的可逆性、抗原抗体的量。

1.2.1 抗原抗体的最适比 抗原抗体的反应虽决定于两者的化学构型的相应性，但不同于一般的化学反应，其结合比例不完全符合化学反应的质量作用定律，因为抗原抗体的结合是一种多价相互作用的结合。抗原根据分子大小的不同，结合位点变化很大，由10~50不等，有的甚至达到200个；卵黄中的抗体成份主要是IgG，有2个结合位点，卵黄抗体除了常见的鸡传染性法氏囊病抗体外，还有鸭病毒性肝炎、猪瘟(边传周等，1999)等高免卵黄抗体，这些抗体的效价都可以用琼脂扩散试验来测定。当抗原抗体的浓度比例适宜时，抗原抗体结合后尚未达到饱和的位点可与其它游离的抗原抗体继续结合，逐渐形成越来越大的复合物。最后在抗原与抗体孔之间形成肉眼可见的沉淀线。此时反应最快、最明显。但当两者的量不适合时，少的一方在聚合初期就达到饱和，沉淀线变得不清晰甚至没有沉淀线，而且沉淀线偏移，向量少的一方移动。

1.2.2 抗原抗体反应的可逆性 抗原抗体之间的结合是依靠分子间的近距离力：氢键、范德华力、静电力、疏水作用力。两者的距离越近，结合的位点越多，形成的近距离力也越大，结合的也越牢固。这些作用力在生理状态下最大。由于抗原抗体反应是分子表面的非分子结合，所形成的复合物并不牢固，可以随时解离，解离的抗原抗体保持原来的生物活性，可与其它的抗原抗体再一次结合，在整个反应体系中形成动态平衡，平衡式为：Ag+Ab≒AgAb。这种平衡受到温度、pH等物理的、化学的因素的影响。当温度大于60℃，pH值降到3以下时，由于同离子效应等因素，使抗原抗体蛋白质的近距离力遭到破坏，结构发生改变，导致抗原抗体复合物重新解离。

1.2.3 抗原抗体的总量 琼脂扩散试验中所形成的沉淀线的粗细、清晰度与抗原抗体的量成正比例关系。抗原反复冻溶以及长期把它放在室温下都使大量的抗原破裂失去活性。所以在保存与运输抗原时应放在冷冻条件下进行。

1.3 抗原抗体本身其他因素

影响琼脂扩散试验结果的抗原抗体因素还包括抗原抗体的纯度。抗原与其对应的抗体的反应属于特异性反应。但是如果两者含有过多与反应无关的蛋白质、类脂质、多糖等非特异性物质，往往抑制抗原抗体的特异性反应，而出现一些非特异性反应。

2 琼脂因素

琼脂扩散试验的结果在很大程度上也受到琼脂的成份、琼脂板厚度、琼脂的浓度、实验用水质量、pH值、电解质浓度、抗原抗体孔间距离及琼脂水分的影响。

2.1 琼脂的成份

影响琼脂扩散试验结果的琼脂成份因素主要是不溶性杂质。一些大的不溶性杂质能直接堵塞琼脂的网格，这样的杂质过多会影响抗原抗体的扩散，为了避免杂质的影响，应在琼脂粉融化后用脱脂棉或纱布过滤。

2.2 琼脂板的厚度

琼脂板的厚度应为3mm，因为由于重力作用，加入孔中的抗原抗体会发生沉淀，导致上下层的浓度形成差，浓度大的向琼脂网格中扩散的速度要比浓度小的快，同时又由于抗原抗体的质量与体积的差异，所以两者形成的浓度差是不同的，扩散速度的差异也不同，如果琼脂板很厚，同一孔上下层扩散速度差异及抗原抗体之间扩散速度的差异都很大，致使抗原抗体孔之间形成的沉淀线上下层之间就不在同一平面上，影响琼脂扩散试验的结果的观察；相反如果琼脂板太薄，所加的抗原抗体量很小，沉淀线不清晰甚至不出现沉淀线。

2.3 琼脂的浓度

琼脂凝胶网格允许通过物质的最大分子量与琼脂浓度成反比见附表(吴冠芸等，1999)。卵黄抗体IgY的分子量为1.8×105(杨婷婷等，2000)，1%~1.5%的琼脂溶液网格能允许绝大多数大分子抗原自由扩散，大于这个浓度范围的琼脂网格太小不利于大分子抗原如鸡马立克氏病病毒(分子量为1.03×108)、鸡传染性喉气管炎病毒(殷震等，1997)的扩散，浓度太小琼脂骨架太少不利于抗原抗体复合物的沉淀，从而影响琼脂扩散试验的结果。

附表 琼脂糖凝胶Bio-Gel A型的数据

型号A-0.5mA-1.5mA-5mA-15mA-50mA-150m 琼脂糖含量%1086421 分级范围(球蛋白)1×104~5×1051×104~1.5×1061×104~5×1064×104~1.5×1071×105~5×1071×106~1.5×108

2.4 试验用水的质量

琼脂扩散试验的结果在很大程度上也受到试验用水的影响。如果试验用水中含大量重金属离子如铅、汞、铜等，会使蛋白质成份的抗原抗体变性失去活性，不能再发生特异性反应，影响琼脂扩散试验的结果。

2.5 pH值

抗原抗体大部分是蛋白质，蛋白质在一定的pH处所带的净电荷数为零，此时的pH值为蛋白质的等电点，大部分蛋白质的等电点在pH5~5.5之间，在等电点处，蛋白质分子之间静电斥力减少，趋于凝集状态而发生沉淀，所以蛋白质在等电点处的溶解度最低。当琼脂的pH在抗原抗体等电点处时，抗原抗体会发生非特异性的沉淀，影响琼脂扩散试验的实验结果。一般琼脂扩散试验的pH为6~8(比等电点稍高)(余传霖等，1998)。当pH小于3时，往往使抗原抗体结合物变性或再次解离，如IgY在pH4.0~11.0稳定，马立克氏病毒在pH3或pH11处理10min失活。

2.6 电解质的浓度

电解质的浓度对琼脂扩散试验的结果影响也很大。抗原抗体具有胶体性质，含有氨基、羧基、肽链等极性基团，与水相互结合，形成水化层，因为蛋白质带有相同的电荷，所以胶体所带电荷相同，互相排斥，在水中稳定存在，抗原抗体带有相反的极性，等两者结合后，表面的电荷减少或消失，水化层也减弱，由亲水型变为疏水型，此时如有适当浓度的电解质，能进一步降低抗原抗体表面的电荷，促进他们沉淀，最常用的电解质为氯化钠，哺乳动物血清学反应浓度为0.15mol，即生理盐水，禽类8%(杨廷彬等，1994)。但过高浓度的电解质反而不利于抗原抗体沉淀物的形成，有两个原因：（1）过高浓度的电解质阻止蛋白质与水分子的相互作用，破坏蛋白质表面的水化层，产生盐析效应，使抗原抗体发生非特异性的沉淀。（2）过高浓度的电解质浓度(大于或等于15%)可使抗原抗体结合物离解。

2.7 抗原抗体孔间距离

抗原抗体的孔间距离也能影响琼脂扩散试验的结果。琼脂扩散试验是利用可溶性的抗原抗体在琼脂凝胶所形成的网格中自有扩散，形成浓度梯度，在适当浓度处相互结合，形成沉淀线。当两者之间的孔距为3mm时，抗原抗体既能形成合适的浓度梯度又能充分结合。当两者的孔间距离过大时，虽然能形成合适的浓度梯度，但由于抗原抗体量太少却不能充分结合，相反孔距太小，虽然结合的量很大却不能形成合适的浓度梯度，都能影响琼脂扩散试验的结果。

2.8 琼脂水分

琼脂凝胶网格内含有大量水分，如果琼脂板储存时间太长或储存环境太干燥又没有放在密闭环境中，水分就会大量的挥发，直接影响抗原抗体扩散的效果。

3 放置条件

一些培养条件如放置温度、放置湿度、放置时间也是影响琼脂扩散试验结果的重要因素。

3.1 放置温度

影响琼脂扩散试验结果的温度因素包括:放置温度的高低与放置温度波动情况。

3.1.1 放置温度的高低 抗原抗体的反应速度、结合程度与反应温度高低有密切关系，温度高，分子运动加快，增加抗原抗体碰撞几率，反应会加快，但当温度超过56℃时反应速度反而变慢，温度再高，抗原抗体复合物往往会重新解离，甚至会被破坏，例如卵黄抗体在≥65℃情况下性质就会变得不稳定，鸡马立克氏病毒从感染鸡皮肤中制备的脱离细胞制剂在56℃处理30min或在60℃处理10min都能失活，传染性法氏囊病病毒在70℃处理30min失活(殷震等，1997)。反应温度低时，反应速度变慢，但抗原抗体结合完全，沉淀量增多，结果清晰。但温度过低，反应无法进行，也不会出现结果。最适的反应温度为37℃(杨廷彬等，1994)。

3.1.2 放置温度的波动情况 琼脂扩散试验的培养温度应恒定，如果波动太大，会使抗原抗体在扩散时形成不连续的浓度梯度，影响两者产生最适比，最终影响到试验结果。

3.2 空气湿度

琼脂扩散试验是抗原抗体在琼脂网格中的水中扩散时形成的，如果空气中湿度太低，琼脂中的水分很容易蒸发，使琼脂网格中的水分减少，不利于抗原抗体的自由扩散，同时加到琼脂孔中的抗原抗体的水分也很容易蒸发，使卵黄中的抗体及抗体被固定在孔中不容易向琼脂凝胶中扩散。所以在培养时，往往倒置平皿，然后放在一个有湿棉纱布的有盖搪瓷盘中，以防水分蒸发。

3.3 放置时间

琼脂扩散的结果也受到放置时间的影响。抗原抗体在琼脂中的扩散需要一定时间。如果放置时间太短，使抗原抗体没有完全扩散以致结合的不充分或结合后还没有达到沉淀的程度，导致本应形成的沉淀线没有出现。时间太长，在室温条件小，大量抗原抗体会失去生物活性，已经形成的沉淀带发生解离消失而出现假像。

4 其他因素

抗原抗体加的多少、打孔后琼脂底部融封效果都能影响琼脂扩散试验的结果，当抗原抗体的量加的多时，所产生的沉淀线粗，为了减小各个实验的相对误差，加样时，都应加到满而不溢程度。此外，打孔后琼脂板底部松动，如果不加热封好，在实验过程中，抗原抗体就不通过琼脂网格扩散，而是直接在底部流出，不会产生沉淀线。

总之，琼脂扩散试验能有效的指导养殖户、兽医工作者制定合理的免疫程序，但是由于受到诸多因素的影响，因此，为了得出真实的试验结果，操作者应本着科学、严谨的态度进行操作，以克服不良因素的影响。

[1] 王明俊等. 兽医生物制品学[M]. 北京: 中国农业出版社. 1997.

[2] 余传霖等. 现代医学免疫学[M]. 上海: 上海医科大学出版社. 1998.

[3] 甘肃农业大学主编. 兽医微生物学[M]. 北京: 中国农业出版社. 1999, 151.

[4] 边传周等. 鸡抗猪瘟高免卵黄抗体的研制[J]. 中国兽医杂志, 1999, 41.

[5] 杨婷婷等. 鸡卵黄抗体(IgY)的提纯及其在医学上的应用[M]. 中国人兽共患病杂志. 2000, 76.

[6] 殷震等. 动物病毒学[M]. 北京: 科学出版社. 1997.

[7] 吴冠芸等.生物化学与分子生物学实验常用数据手册[M]. 北京: 科学出版社. 1999.

[8] 杨廷彬等. 实用免疫学[M]. 长春: 长春出版社. 1994.

（2012–08–07）

S852.4+3

C

1007-1733(2012)11-0080-03