虫纹鳕鲈线粒体COI基因片段的克隆与序列分析

虫纹鳕鲈线粒体COI基因片段的克隆与序列分析

对虫纹鳕鲈(Maccullochellapeelii)线粒体DNA细胞色素氧化酶I亚基(cytochrome oxidase subunit I，COI)基因进行了扩增、克隆和测序，并对COI序列进行了分析。结果显示，澳洲虫纹鳕鲈COI基因序列长度为652bp，A、C、T、G 4种碱基平均比例分别为25.3%、16.6%、32.9%、25.2%，A+T比例 (58.2%)明显高于G+C (41.8%)。与从GenBank中查到的其他6种真鲈科鱼类的同源序列比对，并采用最大简约法(MP)构建系统进化树，结果显示：7种真鲈科鱼类聚在一起，分为2个大的支系，麦鳕鲈属鱼类聚为一支，麦氏鲈属、鳜属和花鲈属的鱼类聚为一支。其中，花鲈属的花鲈与鳜属鱼类亲缘关系较近，与其他两属关系稍远。所得的聚类结果与传统的形态分类基本一致。

虫纹鳕鲈(Maccullochellapeelii)；COI基因；克隆；序列分析

虫纹鳕鲈(Maccullochellapeelii)隶属硬骨鱼纲(Osteichthyes)鲈形目(Perciformes)真鲈科(Percichthyidae)麦鳕鲈属(Maccullochella)，原产于澳大利亚东南部墨瑞达令河流域。此鱼为世界上最大淡水鱼之一，生长速度快、环境适应力强、繁殖力强。不仅适合水产养殖，亦可做观赏鱼。目前国内虽有几家单位引进了虫纹鳕鲈，但有关研究尚少，主要集中在其生物学特性及驯化养殖等方面[1-4]，对其线粒体DNA(mtDNA)的研究尚未见报道。

COI基因是线粒体氧化呼吸链的重要成员，进化速度快，包含的遗传进化信息量大，在鱼类群体遗传结构和系统进化等领域应用较广[5-7]。本研究对引进虫纹鳕鲈mtDNA COI基因序列片段进行了扩增和测序，并对其序列特征进行了分析，结合GenBank中已报道的其他6种真鲈科鱼类COI基因的同源序列进行了比较，以期为虫纹鳕鲈的种质资源和遗传育种研究提供背景资料，并为真鲈科鱼类分类和系统进化提供分子生物学上的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用虫纹鳕鲈样本取自山东济南罗非鱼国家级良种场东温室水泥池，由山东省淡水水产研究所从澳大利亚引进。每个个体取新鲜肌肉，于-70℃超低温冰箱中保存待用。

1.2 总DNA的提取与检测

取100mg样品低温下剪碎并研磨为糊状，采用生工生物工程(上海)股份有限公司的UNIQ-10柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取总DNA，保存于-20℃冰箱用于PCR扩增。

1.3 PCR扩增

采用已报道的一对通用引物扩增虫纹鳕鲈COI基因。引物序列分别为：COIa：5’-AGTATAAGCGTCTGGGTAGTC-3’和COIf：5’-CCTGCAGGAGGAGGAGAYCC-3’[8]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用TaKaRa公司的TP650型PCR扩增仪扩增，PCR总反应体积为50μl，反应体系为：10×buffer 5μl，25mmol/L的MgCl24μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，引物(各10μmol/L)为2μl，DNA模板2μl，Taq酶(TaKaRa，5U/μl)0.4μl，由灭菌双蒸水补足至终体积。扩增程序为：94℃预变性2min，然后进行35个循环(94℃1min，56℃1min，72℃1min)，72℃延伸5min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳法检测，凝胶成相系统观察、照相。

1.4 PCR产物纯化与目的片段的克隆

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目的条带，用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化，取目的片段与pMD-18T-Vector(TaKaRa)重组，并转化大肠杆菌DH5a感受态细菌，通过蓝白斑筛选挑取阳性克隆，挑选白色单菌落接种于含有氨苄青霉素的液体培养基中扩大培养，挑选3个经PCR检测合格的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5 序列分析

测得序列通过Clustal X(Version1.83)软件进行多序列比对和分析[9]，采用MEGA5.0[10]软件分析序列的碱基组成和变异位点。从GenBank中搜索到真鲈科其他6种鱼类：艾氏麦鳕鲈(Maccullochellaikei)、圆尾麦氏鲈(Macquariaambigua)、叉尾麦氏鲈(Macquariacolonorum)、鳜鱼(Sinipercachuatsi)、斑鳜(Sinipercascherzeri)和花鲈(Lateolabraxjaponicus)的COI基因片段序列，采用采用最大简约法(MP)构建系统进化树。系统树中各结点的置信度由自引导值(Bootstrap value)估计，重复次数为1000。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增及胶回收纯化结果

虫纹鳕鲈线粒体COI基因经通用引物特异扩增，所有样品均扩增出700bp左右的一条整齐而清晰的条带，未发现非特异性条带，对照组未检测到扩增产物(图 1)，可以排除外源DNA 污染及核DNA 拷贝的可能性。PCR产物经生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化，得到了纯度较高的COI基因片段，电泳结果如图2所示。

C:对照；M:Marker(DL2000)；1～5：样品

M:Marker(DL2000)；1～5：样品

2.2 阳性克隆检测结果

挑取的菌斑经扩大培养和PCR扩增，所得PCR产物在1%的琼脂糖上电泳，结果如图3所示，琼脂糖电泳检测的5个样品都扩增成功，且对照组的产物要比试验组产物的片段小300bp左右，说明目的片段已经连接转化到大肠杆菌中，阳性克隆比例比较高。

1～5：对照组(COIF和COIR引物)；1’～5’：试验组(M13F和M13R引物)；M：DL2000

2.3 COI基因片段的序列特征

将所测澳洲虫纹鳕鲈的mtDNA COI基因片段在除去引物及部分端部序列后，经比对，获得澳洲虫纹鳕鲈线粒体COI基因序列5’端的长度为652bp(图4)。A、C、T、G 4种碱基在3个个体中的平均比例为25.3%、16.6%、32.9%、25.2% ，A+T 比例(58.2%)高于G+C (41.8%)。所测序的3个样本中仅有1处碱基变异，位于220bp处，碱基A转换成了G。

图4 虫纹鳕鲈COI基因片段核苷酸序列

2.4 系统进化树的构建

为比较澳洲虫纹鳕鲈和已报道的真鲈科其他鱼类线粒体DNA COI基因的序列差异，从GenBank中下载了6种其他真鲈科4属鱼类的COI序列进行比对，获得隶属于真鲈科4属共7种鱼类527bp的同源序列(含插入/缺失位点)。其他6种真鲈科鱼类的COI基因序列的长度及其登录号详见表1。

表1 几种真鲈科鱼类COI基因序列的长度及其登录号

注：枝上显示bootstrap 1000个循环的置信度

采用最大简约法(MP)构建了真鲈科科7个种的系统树，系统树各结点的支持率以序列数据集1000次重复抽样检验的自引导值(Bootstrap value)表示，各分支上的数字为重抽样分析得到的大于50的支持率。由系统进化树的拓扑结构(图5)可知，7种鱼类聚成2个大的分支：鳜属2种鱼类首先聚在一起与花鲈属的花鲈聚为一个亚群，然后再与麦氏鲈属2种鱼类聚为一支；而虫纹鳕鲈3个个体先聚在一起，然后再与同属于麦鳕鲈属的艾氏麦鳕鲈聚成一支，表现为与形态学分类结果基本一致，说明mtCOI基因适合于物种间亲缘关系及系统进化的研究。

3 讨论

线粒体DNA是共价闭合的双链分子，其结构简单、进化速度快、几乎不发生重组、呈严格的母系遗传，已成为一种应用较广的分子标记[11]。线粒体DNA不同的区域进化速度存在差异，适合不同水平的进化研究[12]，COI基因该基因近年来在鱼类群体遗传结构和系统进化方面有较多的研究[13-16]。

本研究对澳洲虫纹鳕鲈线粒体DNA COI基因部分片段序列进行了PCR特异性扩增，得到652bp的碱基序列，其中A、C、T、G 4种碱基在3个个体中的平均比例为25.3%、16.6%、32.9%、25.2%。碱基T含量最高，C的含量最低，A+T (58.2%) 含量明显高于G+C (41.8%)，符合脊椎动物 mtDNA COI碱基组成的特点[17]。通过对澳洲虫纹鳕鲈COI基因片段遗传特征的研究，发现其在种内的变异比较低，所测3个样本碱基序列基本一致，仅有1处变异。在mtDNA的基因序列中，由于受到的选择压力不同导致各个区域进化速率不同[18]。张岩等[19]对2种黄盖鲽线粒体DNA3个蛋白编码基因的系统发育信息研究指出核苷酸替代速率最快的是D-loop，COI和Cyt b核苷酸替代速率基本一致。Zardoya等[20]研究了脊椎动物的13个蛋白编码基因所包含的系统发育信息情况指出，ND4、ND5、Cyt b和COI含有良好的系统发育信息。彭士明等[21]采用线粒体D-loop区与COI基因序列比较分析了养殖与野生银鲳群体遗传多样性，基于D-loop序列的分子方差(AMOVA)分析显示养殖与野生银鲳群体间具有较高的遗传分化，而基于COI基因片段AMOVA分析显示两群体间并无明显的遗传分化，说明线粒体D-loop区作为反映银鲳群体间遗传多样的敏感度要高于COI基因。本研究中所测3个虫纹鳕鲈COI基因序列基本一致也同时验证了COI基因比较保守这一事实，COI基因可能更适用于种间及种以上阶元的分析。要进一步了解虫纹鳕鲈的群体遗传结构及遗传多样性等还需借助其他方法，如对进化速率更快的D-loop区进行测序分析，或者采用SSR或者AFLP法扫描信息量更大的核DNA。

同时，与从GenBank中查到的其他6种真鲈科鱼类的同源序列比对，并采用最大简约法构建系统进化树，结果显示7种真鲈科鱼类聚在一起，分为2个大的支系，鳕鲈属的2种鱼类聚为一支；麦氏鲈属、鳜属以及花鲈属的鱼类聚为一支。由聚类结果可知，花鲈属的花鲈与鳜属鱼类亲缘关系较近，与其他两属鱼类亲缘关系稍远，表现为与形态学分类结果相一致。

澳洲虫纹鳕鲈具有生长速度快、环境适应力强、繁殖力强等特点，养殖前景十分看好。本研究结果为进一步研究澳洲虫纹鳕鲈的遗传变异、种群结构和系统进化打下了基础，但要了解其更多的遗传背景，尚需借助其他分子生物学手段和资料。

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10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.08.009

Q785；Q959.483

A

1673-1409(2012)08-S025-05

2012-08-01

农业部“948”计划项目(2011-z41)。

张龙岗(1982-)，男，山东济宁人，硕士，助理研究员，主要从事鱼类遗传育种研究。

朱永安， E-mail：zhuyongan1965@163.com。