绞股蓝皂甙对阿尔茨海默病小鼠海马胆碱能系统功能的影响

周卫华 谭莉明 米长忠 钟 飞 (吉首大学医学院，湖南 吉首 416000)

绞股蓝皂甙对阿尔茨海默病小鼠海马胆碱能系统功能的影响

周卫华 谭莉明 米长忠 钟 飞 (吉首大学医学院，湖南 吉首 416000)

目的 探讨绞股蓝皂甙对D-半乳糖(D-gal)所致阿尔茨海默病(AD)模型小鼠海马胆碱能系统功能的影响。方法 昆明小鼠颈背部皮下注射10%D-gal，连续6 w造模。同时，各组分别灌胃生理盐水(正常对照组、模型组)、绞股蓝(高、低剂量组)。给药结束后进行水迷宫训练，24 h后进行学习记忆功能测试和海马胆碱乙酰基转移酶(ChAT)与乙酰胆碱酯酶(AchE)活性测定以及Western印迹检测ChAT表达。结果 与正常对照组相比，D-gal模型组小鼠学习记忆能力，模型组ChAT活性和ChaT表达明显下降(P＜0.05，P＜0.01);模型组AchE活性明显升高(P＜0.01)。给予绞股蓝皂甙可明显改善AD模型小鼠的学习记忆功能(P＜0.05，P＜0.01)，增强海马ChAT活性(P＜0.01)和降低AchE活性(P＜0.01)，上调ChAT的表达(P＜0.01)。结论 绞股蓝皂甙可明显提高模型小鼠的学习记忆能力，改善海马胆碱能系统功能。

绞股蓝皂甙;半乳糖;阿尔茨海默病;胆碱能系统

绞股蓝为我国的名贵中草药，在湘西地区广泛种植和饮用，已有研究表明绞股蓝对学习记忆障碍具有明显的改善作用〔1，2〕。绞股蓝皂甙(GP)是从中分离出来与人参皂甙有类似骨架的达玛烷型绞股蓝皂甙，具有多种生理活性;其中抗癌、抗衰老、抗溃疡、镇静、镇痛、降血脂等作用〔3〕，已得到药理和临床研究的证实。研究表明，中枢胆碱能系统是学习记忆的重要机制。乙酰胆碱(ACh)是中枢胆碱能神经系统的一种重要递质，参与学习和记忆等相关生理活动，胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(AChE)是ACh代谢的2个关键酶，本研究旨在观察GP对小鼠中枢胆碱能系统的影响，探讨GP影响学习记忆能力的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

22 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

昆明种雄性小白鼠，6～8周龄、体重18～

1.2 实验药物试剂及仪器

绞股蓝皂甙购于陕西浩洋生物科技有限公司，D-半乳糖D-gal，(购自北京化学试剂公司)，AchE试剂盒、ChAT试剂盒及BCA蛋白测试盒均购于南京建成生物工程研究所。低温高速离心机(TGL-16G)，UV-3100紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)，凝胶成像系统(BINTA2020D，深圳宇德立生物科技有限公司)，半干式转膜仪(DYCP-40C，北京六一厂)，羊源抗鼠ChAT抗体，辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG，β-actin小鼠多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠IG，均购于Santa公司，ECL试剂盒(Pierce公司)。

1.3 动物模型制备〔4〕

将小鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组10只。模型组、治疗组，每日颈背部皮下注射10%D-gal 125 ml·kg－1·d－1，持续 6 w，空白组注射同剂量的生理盐水。从第1天开始，绞股蓝高剂量组和低剂量组〔5〕，分别灌胃给予180和60 mg·kg－1·d－1进行实验干预，模型组和空白组也灌胃等量的生理盐水。

1.4 小鼠学习能力测定〔4〕

采用改良的Morris水迷宫实验，即将小鼠从槽壁四个起始点分别放入水槽中，记录从放入小鼠到小鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)，小鼠找到平台后，让小鼠在平台上休息30 s，如小鼠120 s仍找不到平台，则由实验者将小鼠放置于平台上，逃避潜伏期记为120 s，也让小鼠在平台上休息30 s。造模成功后，进行定向航行实验，记录每只小鼠潜伏期的平均值。

1.5 海马ChAT和AChE活性检测

小鼠水迷宫测试结束后迅速断头取脑，分离两侧海马组织，按1∶10质量比加入生理盐水，匀浆30 s，匀浆液在4℃以4 000 r/min离心10 min，吸取上清－20℃冰冻备用，按试剂盒说明书测定AChE活性，同时采用BCA蛋白测定试剂盒测定海马组织蛋白含量。

1.6 海马组织匀浆液制备及Western印迹

分离海马组织，匀浆液用BCA法进行总蛋白定量，从各组样品中分别取60 μg的总蛋白上样，用8%SDS-PAGE，4℃，20 mA电泳，当指示剂溴酚蓝电泳到分离胶时调节电流为30 mA，继续电泳2.5 h。通过半干式电转法将蛋白从SDS-PAGE胶上转移到硝酸纤维素(NC)膜上，转膜1 h。NC膜用10%脱脂牛奶常温下封闭2 h，羊源抗鼠ChAT抗体(1∶1 000)孵育4 h，再与HRP标记的兔抗羊IgG二抗(1∶2 000)孵育1 h。按ECL试剂盒说明书进行显色反应。暗室中曝光，显影，定影。用凝胶成像系统分析目标带的光密度值。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 绞股蓝皂甙对衰老模型小鼠学习记忆的影响

小鼠用D-gal皮下注射连续6 w后模型组，逃避潜伏期延长〔(38.5±7.66)s〕，与正常组相比有显著性差异〔(24.1±7.30)s，P＜0.01〕，灌胃给予绞股蓝皂甙高、低剂量组后，逃避潜伏期缩短，与模型组相比有显著性差异〔(27.8±6.44)、(30.8±6.61)s，P ＜0.01，P ＜0.05〕。

2.2 绞股蓝皂甙对小鼠海马组织生化指标的影响

模型组小鼠海马组织ChAE活性升高，ChAT活性降低，与正常组有显著性差异(P＜0.01)，绞股蓝皂甙灌胃给药后小鼠海马组织中ChAE活性降低，ChAT活性升高，与模型组有显著性差异(P＜0.05，P ＜0.01)。见表1。

表1 绞股蓝皂甙对各组小鼠海马组织ChAE活性、ChAT含量的影响(±s，n=10，U/mg)

表1 绞股蓝皂甙对各组小鼠海马组织ChAE活性、ChAT含量的影响(±s，n=10，U/mg)

ChAE ChAT正常组 1.16±0.471) 86.5±10.381)组别模型组 1.97±0.58 69.9±8.78绞股蓝低剂量组 1.32±0.421) 79.4±10.72)绞股蓝高剂量组 1.24±0.411) 84.7±9.981)

与模型组比较：1)P＜0.01;2)P＜0.05

2.3 绞股蓝皂甙对海马组织ChAT蛋白的表达的影响

模型组小鼠海马组织ChAT的表达降低(0.348±0.034)，与正常组有显著性差异〔(0.645±0.013)，P＜0.01〕，高、低剂量绞股蓝皂甙灌胃给药后小鼠海马组织中ChAT的表达明显升高，与模型组有显著性差异〔(0.526±0.064)、(0.487±0.039)，P＜0.01〕。

3 讨论

注射大剂量D-gal会引起氧自由基在体内过量堆积，产生一系列与老化和AD相似的病理、生理改变，可作为部分模拟AD的动物模型〔6〕。研究发现，注射D-gal可致大鼠、小鼠学习记忆功能障碍〔7，8〕。在本研究中，大量注射D-gal使AD模型小鼠学习记忆能力下降，在水迷宫中寻找到平台的潜伏期明显延长，在研究中，GP对D-gal所致AD模型小鼠学习记忆障碍具有明显改善作用。

乙酰胆碱的合成酶ChAT可催化乙酰辅酶A和胆碱生成乙酰胆碱，其分布与Ach的分布几乎平行，故常作为估计Ach含量的间接指标〔9〕。而AchE的活性能间接反映乙酰胆碱在脑中分解率的变化;两者共同调节脑内ACh的含量，其活性变化可间接反映脑内ACh的代谢情况〔10〕。AD患者中枢神经系统胆碱能神经功能明显下降，其临床症状的严重程度和胆碱能系统的活性密切相关，研究表明老年痴呆病人脑组织中AchE活性显著升高〔11〕，使Ach分解增加，造成Ach减少，导致学习和认知能力下降。本研究提示GP可以提高衰老模型小鼠学习记忆能力，其机制可能与GP提高ChAT活性、升高ChAT蛋白表达，从而促进脑内ACh合成有关，GP改善海马胆碱能系统功能是其改善AD小鼠学习记忆功能的基础。

1 张晓喻，黎 艳，雍 彬，等.复方绞股蓝皂甙改善小鼠学习记忆的研究〔J〕.食品科学，2007;28(3)：330-3.

2 邓家刚，杜正彩，郝二伟.复方绞股蓝对小鼠学习记忆及脑内单胺氧化酶活性的影响〔J〕.世界中西医结合杂志，2007;2(12)：692-4.

3 杨 辉.绞股蓝皂试药理研究进展〔J〕.淮南师范学院学报，2001;3(2)：42-3.

4 周卫华，米长忠，吴仕筠，等.果王素对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆功能的改善作用〔J〕.时珍国医国药，2010;21(8)：1915-6.

5 安丽霞，赵 俊.绞股蓝总皂甙对小鼠抗衰老功能的影响〔J〕.上海畜牧兽医通讯，2007;5(9)：31-3.

6 陆盈盈，高良才，袁崇刚.D-半乳糖致老年性痴呆模型的评价和海马脑区甘丙肽表达研究〔J〕.中国神经免疫学和神经病学杂志，2007;14(1)：191-3.

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8 王爱梅，李 弋.葛根异黄酮对衰老模型大鼠学习记忆及海马乙酰胆碱酯酶的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(15)：2326-7.

9 Bisaglia M，Venezia V，Piccioli P，et al.Acetaminophen protects hippocampal neurons and PC12 cultures from amyloid beta-peptides induced oxidative stress and reduces ChAT activation〔J〕.Neurochem Int，2002;41(1)：43-54.

10 Lyness SA，Zarow C，Chui HC.Neuron loss in key cholinergic and an imergic nuclei in Alzheimer disease：a meta analysis〔J〕.Neurobiol Aging，2003;24(1)：1-23.

11 Bartolucci C，Siotto M，Ghidini E，et al.Structural determinants of Torpedo californica acetyl cholinesterase inhibition by the novel and orally active carbamate based antialzheimer drug ganstigmine(CHF-2819)〔J〕.J Med Chem，2006;49(17)：5051-8.

Effects of gypenosides on the hippocampal cholinergic system in D-galactose induced Alzheimer's disease in mice

ZHOU Wei-Hua，TAN Li-Ming，MI Chang-Zhong，et al.
Jishou University School of Medicine，Jishou 416000，Hunan，China

Objective To investigate the effects of gypenosides on the hippocampal cholinergic system in D-galactose induced Alzheimer's disease(AD)in mice.Methods The mice were given subcutaneous injection of 10%D-galactose for 6 weeks(125 ml·kg－1·d－1).Normal saline，gypenosides respectively were given by intragastric administration in different study groups.The mice were trained to find the platform in the water maze on the 43th day.After 24 hours，learning and memory ability was tested，choline acetyltransferase(chAT)activity，acetylcholinesterase(AchE)activity，the expression of ChAT in hippocampus was observed by Western blotting after treatment.Results Compared with the normal control group，the learning and memory dysfunction，the decreases of ChAT activity and expression of ChAT were found in model group，AchE activity was increased in model group(P＜0.05，P＜0.01).The gypenosides could markedly attenuate cognitive dysfunction，elevate ChAT and expression of ChAT，decrease AchE activity in the hippocampi of mice treated with D-galactose(P＜0.05，P＜0.01).Conclusions The gypenosides can significantly improve the hippocampal cholinergic system function，and thus enhance the learning and memory ability in D-galactose induced AD model mice model.

Gypenosides;D-galactose;Alzheimer's disease;Cholinergic system

R285.5

A

1005-9202(2012)22-4943-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.041

湖南省科技厅基金项目(2011TJ3202);湘西州科技局课题项目(2009zd06)

周卫华(1978-)，男，讲师，硕士，主要从事中医药抗衰老研究。

〔2012-01-04收稿 2012-08-07修回〕

(编辑 曹梦园)