大鼠脑挫伤后脑与其他器官组织中TNF-α表达的比较

严 治，孙小丽，胡玉莲，刘 敏

（1.四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041；2.重庆市公安局物证鉴定中心，重庆 410041）

大鼠脑挫伤后脑与其他器官组织中TNF-α表达的比较

严 治1，2，孙小丽1，胡玉莲1，刘 敏1

（1.四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041；2.重庆市公安局物证鉴定中心，重庆 410041）

目的 比较大鼠脑挫伤组织及其他器官组织中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表达的差异，期望为法医病理学脑挫伤的诊断以及损伤时间的判断提供理论依据。 方法 对45例SD大鼠脑挫伤后脑组织及心、肝、脾、肺、肾等器官组织进行TNF-α免疫组织化学染色，观察脑挫伤对不同器官中TNF-α表达水平的影响。 结果 脑损伤后1h，TNF-α在脑组织即有表达，分别在6h及3d出现两次高峰，7d表达减弱，但仍明显高于正常。心、肝、脾、肺、肾组织中TNF-α在颅脑损伤后1h也有表达，随损伤时间延长，阳性细胞逐渐增多，3d最高，7d虽有所下降，但仍显著高于正常。 结论 在研究脑损伤局部变化的同时，也可研究其他器官组织的相应变化，有助于脑损伤诊断及损伤时间推断。

法医病理学；脑损伤；肿瘤坏死因子α；大鼠

脑损伤在法医学实践中极为常见，有关脑损伤的研究较多，但多集中在颅脑本身[1-2]。机体作为一个有机整体，颅脑损伤必然会导致其他组织的变化，有文献[3]报道创伤性脑损伤不仅可以引起脑水肿、炎性反应和迟发性神经细胞死亡等变化，还可引起其他相关器官发生功能障碍。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是脑感染、创伤、缺血、缺氧等过程中的重要因子，本研究在建立大鼠脑挫伤动物模型的基础上，研究脑组织挫伤区以及心、肝、脾、肺、肾等器官组织中TNF-α表达的变化，并比较脑组织及其他器官组织表达的差异，期望为脑挫伤的法医病理诊断、损伤时间的判断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

兔抗大鼠TNF-α多克隆抗体、即用型SABC免疫组织化学试剂盒（包括5%BSA封闭液、生物素化羊抗兔IgG、ABC复合物、DAB显色试剂等），均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物分组及模型的建立

健康SD大鼠45只（四川达州实验动物中心提供），雌雄不限，体质量160～220g，随机分为正常对照组（5只）、假手术组（5只）、实验组（35只）。实验组建立大鼠脑挫伤模型后，按照颅脑损伤后处死时间不同又分为1、3、6、12h和1、3、7d共7个亚组，每个亚组5只大鼠。

[4-7]的方法建立大鼠脑挫伤模型：大鼠麻醉后除去头皮处鼠毛，用手术刀切开大鼠头部中线皮肤，分离皮下组织筋膜，暴露左侧人字缝与冠状缝之间的颅骨。用质量为25g砝码以自由落体运动打击大鼠左侧顶部颅骨，打击高度为1.6m。砝码头穿透颅骨，入脑2mm，造成大鼠脑挫伤。在脑挫伤模型建立后分别在1、3、6、12h和1、3、7d断颈处死，迅速取出脑、心、肝、脾、肺、肾，用4%多聚甲醛溶液固定2d后，分别在脑挫伤区及其他器官取材，石蜡包埋、切片。假手术组麻醉及手术步骤与实验组相同，但不用砝码打击动物头部。正常对照组及假手术组均在相应部位进行取材作为对照。

1.3 免疫组织化学染色

常规石蜡切片，按试剂盒说明书进行免疫组织化学染色，并另取同样切片进行HE染色。阴性对照以PBS取代一抗。

1.4 图像分析及统计学处理

在光镜下进行观察，脑组织切片分别在左侧挫伤区、双侧大脑皮质区、双侧海马区随机选取5个高倍视野，用Image-Pro Plus图像分析软件测定5个视野内脑组织平均阳性信号积分光密度（integrated optical density，IOD）。其他器官组织每张切片随机选取5个高倍视野，测定5个视野内平均阳性信号IOD。数据应用SPSS 11.5软件包进行单因素方差分析、t检验，数据用±s表示。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 各器官组织常规HE染色

正常对照组及假手术组脑组织及其他器官组织均无明显异常改变。

实验组大鼠伤后1h，损伤局部脑组织片状出血，蛛网膜下腔出血、脑血管充血扩张、脑组织水肿；伤后3h，挫伤灶边缘见小胶质细胞增多，挫伤灶边缘及海马区神经元肿胀，体积增大，核膜尚清，核仁深染偏位或消失；伤后6h，脑组织水肿更加明显；伤后12h，挫伤灶远离部位及海马区部分神经元肿胀，核膜不清，个别核溶解消失；伤后1d，挫伤灶周围见炎症反应；伤后3d，神经细胞坏死更明显；伤后7d，挫伤灶边缘见明显炎症反应。

实验组大鼠伤后1 h，肺组织部分肺小动脉及毛细血管淤血；伤后1d，肺间质毛细血管充血明显，部分肺泡间隔增宽；伤后3 d上述改变更加显著，并见部分肺泡内充满红染均质液体，部分肺泡萎陷；伤后7d，水肿减轻，肺泡间隔仍宽，细胞数量明显增多。心肌各时间段仅见间质淤血改变。肝窦增宽、充血扩张。肾、脾各组仅见间质血管充血。

2.2 各器官组织TNF-α染色

2.2.1 大鼠脑组织TNF-α染色

正常对照组及假手术组大鼠脑组织TNF-α染色阳性信号无表达或仅见个别细胞表达（图1A）。实验组伤后1h，在挫伤灶周围、大脑皮质、海马区均见呈弥散性分布的阳性染色的神经细胞和胶质细胞，细小的阳性棕褐色颗粒均匀分布于神经细胞和胶质细胞质内，挫伤灶周围及海马区域阳性细胞数较多；伤后3h，阳性细胞数量稍增多，细胞内棕褐色着色略微增强；伤后6h，阳性细胞数明显增多，胞浆阳性颗粒着色较深，达到第一高峰（图1B）；至伤后1d，阳性细胞数量减少，胞核和胞浆着色变浅；伤后3d，胞浆阳性颗粒着色较深，达到第二高峰（图1C）；伤后7d，阳性细胞数量减少，胞浆着色变浅，但仍高于正常水平。各实验组与正常对照组及假手术组相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

图1 大鼠脑组织TNF-α染色结果

表1 大鼠各组织TNF-α的阳性信号IOD值 （n=5，±s）

表1 大鼠各组织TNF-α的阳性信号IOD值 （n=5，±s）

组别 脑 心 肝 脾 肺 肾正常对照 138.4±62.9 112.7±52.4 128.4±52.6 242.9±69.7 355.6±74.5 135.8±74.1假手术 142.5±72.6 105.6±53.5 130.5±64.6 253.7±50.6 345.8±84.6 142.2±84.4伤后1h 4246.3±553.6 935.6±184.8 1292.1±204.5 1112.8±256.4 3846.3±523.6 2673.4±289.5伤后3h 8776.8±532.6 1525.4±187.3 1675.7±172.4 1578.6±174.3 5536.8±344.7 4895.7±547.3伤后6h 12396.4±1032.4 1884.9±179.5 2078.5±177.4 2182.4±165.4 7851.6±593.6 5687.5±586.2伤后12h 10882.3±642.7 2948.3±178.2 3967.8±172.7 3896.5±228.6 9021.9±712.7 8536.2±645.8伤后1d 9076.9±736.8 3269.3±214.6 4226.3±198.6 4357.2±189.5 11329.1±832.5 10238.8±814.3伤后3d 16835.8±977.4 4253.6±356.7 7342.6±270.4 7678.6±307.8 17826.7±896.4 16834.9±896.6伤后7d 3903.4±452.7 925.4±147.5 1075.7±194.6 1078.6±177.8 2836.8±284.2 1983.8±545.3

2.2.2 大鼠心、肝、脾、肺、肾组织TNF-α染色

正常对照组及假手术组大鼠心、肝、脾、肺、肾组织在各时间段内TNF-α基本不表达或个别细胞呈弱阳性表达（图2A～B）。实验组伤后1 h，肺、肾组织TNF-α免疫组织化学染色阳性细胞开始增多，主要分布在肺细支气管上皮细胞及肾髓质；心脏阳性细胞为心肌细胞，表达较弱；肝表达较弱，阳性细胞主要为肝细胞；脾在红白髓中呈散在分布，表达亦较弱。伤后3 h，肺内支气管上皮细胞染色略加深，阳性细胞稍增多，在肺泡间隔及肺泡上皮细胞见少量散在分布的TNF-α阳性细胞；肾髓质内阳性细胞稍增多，染色略加深，个别肾小球见TNF-α阳性细胞；心、肝、脾组织内阳性细胞数量稍增多，细胞内棕褐色着色略微增强。伤后12 h，肺细支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞及肺泡间隔内阳性颗粒着色更深，阳性细胞数明显增多；肾髓质内阳性细胞明显增多，胞浆阳性颗粒着色更深，部分肾小球内阳性颗粒着色亦增多；心、肝、脾阳性细胞数量增多，细胞内棕褐色着色增强。伤后3 d，肺、肾、肝、脾、心组织内阳性细胞数量达高峰，着色最深（图2C～D）。伤后7d，阳性细胞数量减少，胞浆着色变浅，但仍明显高于正常。各实验组与正常对照组及假手术组组织中TNF-α阳性信号IOD值相比较，差异具有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

图2 大鼠肺、肾组织TNF-α染色结果 ABC×200

3 讨 论

3.1 大鼠心、肝、脾、肺、肾组织中TNF-α的表达规律

本研究发现，颅脑损伤后，肺内TNF-α表达较强，伤后1h，细支气管上皮细胞胞浆内开始表达，伤后3h肺泡上皮细胞及肺泡间隔少量TNF-α表达，伤后12 h表达增强，伤后3 d表达达高峰；伤后7 d，表达减弱，但明显高于正常。肾组织中表达亦较强，伤后1h，肾小管上皮细胞就有表达，伤后3h，TNF-α在个别肾小球内有表达，伤后12h，表达增强，伤后3d，表达达高峰；伤后7 d，表达减弱，但仍明显高于正常。心、肝、脾内TNF-α表达较弱，伤后1h，在心肌细胞、肝细胞及脾红白髓内TNF-α开始表达；伤后12h，表达逐渐增强；3 d达高峰，伤后7 d表达减弱，但仍明显高于正常。本研究结果表明在大鼠脑挫伤后，心、肝、脾、肺、肾组织中均有TNF-α表达，并呈现一定规律性变化，且均在3d左右达高峰。

3.2 颅脑损伤后脑组织TNF-α表达规律

Fan等[8]研究发现，大鼠脑液压冲击伤后，TNF-α mRNA在脑损伤早期（伤后1h）即可被检测到，TNF-α mRNA不只在脑损伤侧表达，而且在非损伤侧半球同样表达。Shohami等[9]采用脑液压冲击伤后，脑组织中TNF-α的表达在损伤同侧8h达到最大，一直延续到伤后18h，表达开始下降。陈成春等[10]研究发现，脑挫伤后脑组织中TNF-α的合成在损伤2h后明显升高，6h达到最高后，迅速下降，至伤后1d基本恢复正常水平，伤后3 d其合成水平再次升高，至第5天达到高峰后缓慢下降，伤后10d恢复至伤前水平。本实验研究发现大鼠脑挫伤后1h，就可以检测到TNF-α的表达，之后在6h及3d出现两次峰值，这与陈成春等研究基本一致。Soares等[11]发现外伤性脑损伤后18～24h，多型核中性白细胞在脑内聚集。Dubravec等[12]通过体外细胞培养发现血液中的多型核中性白细胞能够产生TNF-α mRNA和分泌TNF-α蛋白。提示在3d左右发生TNF-α表达的第二个高峰，可能与此有关。

3.3 大鼠脑组织及其他器官组织TNF-α染色结果比较

本研究发现，大鼠脑挫伤后1 h，在脑挫伤区、双侧海马及双侧大脑皮质区神经细胞及胶质细胞胞浆内就可以检测到TNF-α的表达，分别在6h及3d出现两次高峰，心、肝、脾、肺、肾组织在颅脑损伤后1h就有表达，第3天最高，7d虽有所下降，但仍显著高于正常。说明颅脑损伤后脑及其他器官组织中均有TNF-α表达，但脑内与其他器官组织表达峰值时间存在一定差异。本研究表明对于颅脑损伤者，除可研究脑损伤局部组织外，亦可同时研究其他器官组织，有助于脑损伤诊断及脑损伤时间推断。

参考文献：

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[2] Liu T，Clark RK，McDonnell PC，et al.Tumor necrosis factor-alpha expression in ischemic neurons[J]. Stroke，1994，25（7）：1481-1488.

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[7] 陈建良，吕文，郭伟，等.大鼠脑损伤动物模型研制方法的探讨[J].中华实验外科杂志，2003，20（3）：281-283.

[8] Fan L，Young PR，Barone FC，et al.Experimental brain injury induces differential expression of tumor necrosis factor-alpha mRNA in the CNS[J].Brain Res Mol Brain Res，1996，36（2）：287-291.

[9] Shohami E，Novikov M，Bass R，et al.Closed head injury triggers early production of TNF alpha and IL-6 by brain tissue[J].J Cereb Blood Flow Metab，1994，14（4）：615-619.

[10]陈成春，黄涛，金建华.脑挫伤后肿瘤坏死因子α表达水平变化的实验研究[J].中国临床解剖学杂志，2006，24（1）：90-92.

[11]Soares HD，Hicks RR，Smith D，et al.Inflammatory leukocytic recruitment and diffuse neuronal degeneration are separate pathological processes resulting from traumatic brain injury[J].J Neurosci，1995，15（12）：8223-8233.

[12]Dubravec DB，Spriggs DR，Mannick JA，et al.Circulating human peripheral blood granulocytes synthesize and secrete tumor necrosis factor alpha[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1990，87（17）：6758-6761.

2011-01-17）

（本文编辑：刘宁国）

Different Expression of TNF-α in Brain and Peripheral Organs after Cerebral Contusion of Rats

YAN Zhi1,2,SUN Xiao-li1,HU Yu-lian1,LIU Min1
（1.West China School of Basic Medicine and Forensic Medicine,Sichuan University,Chengdu 610041,China; 2.Institute of Forensic Science,Chongqing Public Security Bureau,Chongqing 410041,China）

Objective To compare the expression of tumor necrosis factor-α（TNF-α）between brain and peripheral organs after cerebral contusion in order to provide the scientific theoretical basis for forensic pathological diagnosis and wound age estimation.Methods Brain and peripheral organs including heart, liver,spleen,lung,kidney tissues of 45 SD rats after the cerebral contusion were obtained and TNF-α of these tissues were analyzed with immunohistochemistry methods.Results TNF-α was detected at 1 h in brain,reaching maximum at 6h and 3d after the cerebral contusion,and then decreased but still kept at high expression level at 7d.TNF-α was detected at 1h after the cerebral contusion in heart,liver,spleen, lung and kidney tissues.The number of cells expressing TNF-α increased gradually,reaching maximum at 3 d after the contusion of brain,and then decreased but still kept at high expression level at 7 d.Conclusion Besides the change of cerebral contusion,this study considered both the brain and peripheral organs.It is helpful for forensic pathological diagnosis and wound age estimation after contusion of brain.

forensic pathology;brain injuries;tumor necrosis factor-α;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.04.005

1004-5619（2012）04-0261-04

严治（1981—），男，四川巴中人，硕士研究生，主要从事法医病理学研究；E-mail：yanzhiyx2000@163.com

刘敏，男，教授，硕士研究生导师，主要从事法医病理学科研、教学工作；E-mail：min8liu@hotmail.com